大腸癌中hsp27和p14ARF的表達(dá)及意義

1、大腸癌中hsp27和p14ARF的表達(dá)及意義 作者：左國(guó)進(jìn) 朱潤(rùn)慶 劉衛(wèi)容 夏東【摘要】 目的： 研究hsp27和p14ARF在大腸癌中的表達(dá)及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法： 利用SP 法檢測(cè)48 例大腸癌和10例大腸腺瘤以及15正常大腸黏膜組織中hsp27和p14ARF的蛋白表達(dá)。結(jié)果：大腸癌組織中hsp27和p14ARF表達(dá)陽性率分別為79.2%、58.4%，大腸腺瘤組織中分別為40%、70%，正常大腸粘膜組織中分別為33.3%、80%； p14ARF在高、中分化腺癌組的表達(dá)率為64.1%，顯著高于低分化組22.2%（P<0.05)； 兩者在大腸癌組織中的表達(dá)無明顯相關(guān)

2、性。結(jié)論： hsp27和p14ARF可能與大腸癌的發(fā)生有關(guān), 同時(shí)，p14ARF的表達(dá)與大腸癌的臨床病理分級(jí)有關(guān)，其低表達(dá)可能參與了大腸癌的去分化過程。 【關(guān)鍵詞】 大腸癌； hsp27； p14ARF； 免疫組織化學(xué)近年來的很多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移和預(yù)后與多因素有關(guān)。其中腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。研究表明hsp27和p14ARF在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP 法對(duì)大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸黏膜組織中hsp27和p14ARF的表達(dá)進(jìn)行研究, 探討它們?cè)诖竽c癌發(fā)生發(fā)展中的意義及其與臨床病理表現(xiàn)的關(guān)系。1 材料與方法1.1 標(biāo)本 收集武

3、漢大學(xué)中南醫(yī)院20052006年手術(shù)切除的大腸癌患者組織標(biāo)本48例、大腸腺瘤10例、正常黏膜15例取自大腸癌根治標(biāo)本距腫塊切緣5cm 以上粘膜。腫瘤患者中男性27例，女性21例，年齡3694歲，平均年齡65歲。按組織學(xué)分級(jí): 其中高分化癌10 例、中分化癌29 例、低分化癌9 例; 按Dukes 分期:A 期癌13 例、B 期癌25例、C 期癌10 例。標(biāo)本均用10中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，作厚4m的連續(xù)切片。所有組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。1.2 免疫組織化學(xué)方法 采用SP 法, 操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。鼠抗人HSP27、p14ARF 單克隆抗體及SP 試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)

4、公司。DAB 顯色, 蘇木素復(fù)雜。用已知陽性切片作陽性對(duì)照,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 代替一抗作陰性對(duì)照。1.3 免疫組化結(jié)果判斷 免疫組化HSP27和p14ARF陽性染色主要定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為在胞核和胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒，參照文獻(xiàn)1方法觀察hsp27和p14ARF蛋白的分布、陽性強(qiáng)度和陽性率。先按染色強(qiáng)度打分: 0 分為無色, 1 分為淺黃色, 2 分為棕黃色, 3 分為棕褐色, 染色強(qiáng)度需與背景著色相對(duì)比; 再按陽性細(xì)胞所占百分比打分: 0 分為陰性, 1 分為陽性細(xì)胞10% , 2 分為11% 50% , 3 分為51% 75% , 4 分為>75% ,

5、染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積2 分為免疫反應(yīng)陽性(+ )。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用2檢驗(yàn)和四格表的精確概率法及計(jì)數(shù)資料的相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)均在SPSS11.5軟件上處理。以P0.05為有顯著性差異。2 結(jié)果2.1 HSP27和p14ARF在不同組織中的表達(dá) 在48例大腸癌組織中，HSP27和p14ARF表達(dá)陽性率分別為79.2%(38/48)、58.4%(28/48)。 在10例大腸腺瘤組織中，HSP27和p14ARF各有4、7例陽性表達(dá)，陽性率分別為40%、70%。 在15 例正常腸壁組織中，HSP27和p14ARF的陽性表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，各有5、12例陽性表達(dá)，陽性率分別為33.3

6、%、80%，見表1。表1 HSP27 和p14ARF在不同組織中的表達(dá)（略）注：* 大腸癌與腺瘤組、正常大腸組比較， P0.05。 大腸癌組各指標(biāo)的陽性表達(dá)率與大腸腺瘤、正常大腸組比較，差異具有顯著性意義( P<0.05)，腺瘤組各指標(biāo)的陽性表達(dá)率與正常大腸組的陽性表達(dá)率比較差異無顯著性意義(P>0.05)。HSP27在各組中均有陽性表達(dá)，但在大腸癌中最高，在正常大腸組織中最低。p14ARF在大腸癌、腺瘤及正常大腸組中的表達(dá)與HSP27相反，其陽性表達(dá)率在大腸癌組最低，在正常大腸組最高。2.2 HSP27和p14ARF的表達(dá)與大腸癌臨床病理因素的關(guān)系 HSP27蛋白

7、在癌組織學(xué)分級(jí)中的陽性表達(dá)率為: 高、中分化癌為77.1%，低分化癌為88.8%，各級(jí)癌組間比較差異無顯著性(P=0.341)；在大腸癌Dukes 分期中的陽性表達(dá)率為:A期為76.9% ,B 期為80%,C 期為80% , 各期癌組間比較差異無顯著性(P=0.865)；已伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的C 期癌與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的A、B期癌比較，差異無顯著性(P=0.679)。p14ARF的表達(dá)與臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P1=0.992；P2=0.600)，僅和病理分級(jí)有關(guān)，高、中分化腺癌組的表達(dá)率為64.1%，顯著高于低分化組22.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031) ，見表2。表2 hs

8、p27和p14ARF的表達(dá)與大腸癌臨床病理因素的關(guān)系（略）2.3 大腸癌組織中HSP27和p14ARF表達(dá)的相關(guān)性 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP27和p14ARF在大腸癌中的表達(dá)沒有明顯相關(guān)性(P>0.05)，可能與本實(shí)驗(yàn)的例數(shù)不足有關(guān)。3 討論 大量研究顯示,大腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了多個(gè)發(fā)展階段,涉及多種基因的改變，但確切機(jī)制仍不清楚。 熱休克蛋白是細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組高度保守性蛋白質(zhì),其主要作用是通過在應(yīng)激狀態(tài)下生成保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)必需的蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞的生存。其中熱休克蛋白27（HSP27）是小分子熱休克蛋白（sHSPs）亞家族中的重要一員,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分

9、化和細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,具有重要的生物學(xué)功能。隨著研究的深入,HSP27 與腫瘤的關(guān)系日益受到重視。有學(xué)者先用熱休克方法誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生HSPs( HSP27 和HSP72) ,再應(yīng)用放線菌素等化學(xué)試劑和放射線誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組相比, HSPs 組顯著增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞抵抗上述細(xì)胞毒因素的促凋亡作用,表明HSPs 對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡有抑制作用2 。在乳腺癌患者體內(nèi)HSP27過度表達(dá)可使發(fā)病間期縮短,是惡性乳腺癌預(yù)后不良標(biāo)志3 。HSP27 還可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)激素治療的敏感性,用HSP27 抗體治療,可使乳腺癌患者的生存率提高4 。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP27在大腸腺瘤和正常組織中的表達(dá)與其在大腸

10、癌組織中的表達(dá)有差異，提示HSP27可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡來參與大腸癌的發(fā)生，HSP27 結(jié)構(gòu)和功能的分子機(jī)制研究也發(fā)現(xiàn)HSP27 可形成大分子量聚合體并具有抗凋亡活性。這可能是由于在腫瘤的形成過程中，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，合成代謝增強(qiáng)需要大量的HSP來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這異常增殖過程。正常細(xì)胞，HSP27的表達(dá)受細(xì)胞周期調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞中突變或異常蛋白質(zhì)的存在刺激HSP27的合成, 使其呈現(xiàn)持續(xù)的高誘導(dǎo)表達(dá); 同時(shí)HSP27的高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力，使細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)和死亡減弱。 p14ARF基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因,與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，其編碼產(chǎn)物P14ARF

11、位于p14ARFP53細(xì)胞周期調(diào)空通路上,在G1 / S 和G2 /M 限制點(diǎn)中起關(guān)鍵作用，其可直接結(jié)合MDM2 ,使MDM2 與p53 在核內(nèi)分離,解除MDM2介導(dǎo)的p53 的抑制,使p53 水平升高,然后啟動(dòng)凋亡或細(xì)胞周期阻滯。目前認(rèn)為,p14ARF 基因缺失及啟動(dòng)子甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。在腦轉(zhuǎn)移瘤5 、少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤6 中常發(fā)生p14ARF甲基化現(xiàn)象, 同時(shí),p14ARF啟動(dòng)子甲基化而失活者,在細(xì)胞質(zhì)中可以發(fā)現(xiàn)MDM2 而且p53 表達(dá)失活,用去甲基化試劑處理后,MDM2 又回到胞核而且p53 也表達(dá)7。而在膀胱癌8 、口腔鱗癌9 中常出現(xiàn)p14ARF基因缺失。p14A

12、RF也可發(fā)生突變,但主要發(fā)生在外顯子E2的5端。當(dāng)p14ARF 發(fā)生缺失、甲基化及突變時(shí),其mRNA 及蛋白水平會(huì)相應(yīng)的下降。在本研究中p14ARF在大腸癌中的表達(dá)率為58.4%，顯著低于正常大腸黏膜和腺瘤組織，提示p14ARF的失表達(dá)可能參與大腸癌的發(fā)生。本研究還顯示大腸癌中p14ARF表達(dá)率與腺癌分化程度呈正相關(guān),在高、中分化腺癌組織中p14ARF表達(dá)率是 64.1 % ,低分化腺癌組織中p14ARF表達(dá)率是22.2%,差異有顯著性，說明p14ARF在大腸癌分化過程中同樣發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,確切作用可能是對(duì)大腸癌腫瘤細(xì)胞惡性分化轉(zhuǎn)型具有保護(hù)作用。 綜上所述，hsp27和p14ARF可能與大腸癌細(xì)

13、胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，在大腸癌的發(fā)生和演化中起著重要的作用,其具體機(jī)制及意義仍需日后深入研究。【參考文獻(xiàn)】 1 Iseki K, Tatsuata M , Uehara H, et al. Inhibition of angiogenesis as a mechanism for inhibition by 1hydroxyvitamin D3 and 1,25dihydroxyvitamin D3 of colon carcinogenesis induced by azoxymethane in Wistar rats. Int J Cancer, 1999, 81 (5) : 730

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