PCNA和MMP9在宮頸癌組織中的表達與意義

1、PCNA和MMP9在宮頸癌組織中的表達與意義 作者：孫紅，王浩，秦天潔，阮之平，馬瑾璐 【關鍵詞】 宮頸腫瘤;增殖細胞核抗原；明膠酶B；免疫組織化學Expressions and significance of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue and their significance. METHODS: The immunohistochemical SP staining

2、method was used to evaluate the PCNA and MMP9 expressions in 46 cases of cervix cancer tissues and 10 cases of normal cervix tissues. RESULTS: The expression of PCNA in cervix cancer tissues was much higher than that in normal cervix tissues (P=0.000)；The positive rate of MMP9 protein 82.61% in 46 c

3、ases of cervix cancer was significantly higher than that in 10 cases of normal cervix (30%, P<0.05). There was a positive correlation between PCNA and MMP9 expressions (rs=0.433, P=0.003). The expressions of PCNA and MMP9 were correlated with the clinical stage (P<0.05), but not with a

4、ge, pathological stage or growth pattern (P>0.05). CONCLUSION: The overexpression of MMP9 has a close relationship with the cell proliferation index in cervix cancer, suggesting that MMP9 may play an important role in the development of cervix cancer. 【Keywords】 cervix neoplasms; proliferatin

5、g cell nuclear antigen (PCNA); gelatinase B; immunohistochemistry【摘要】 目的： 探討PCNA，MMP9在宮頸癌組織中的表達及臨床意義. 方法： 用免疫組織化學SP法檢測46例宮頸癌及10例正常宮頸中PCNA和MMP9的表達，分析不同組織中PCNA和MMP9表達的差異及兩者的相關性. 結果： 宮頸癌組織PCNA的表達明顯高于正常宮頸組織(P=0.000)；38例宮頸癌的MMP9陽性表達（82.61%）明顯高于10例正常宮頸組織的表達(30%， P0.05)；PCNA的表達與MMP9的表達呈正相關（rs=0.433, P=0.00

6、3），且PCNA和MMP9均與臨床分期有關（P0.05），而與年齡、病例分級及生長方式無關（P0.05）. 結論： MMP9在宮頸癌組織中表達異常增高，與細胞增殖關系密切，提示其對宮頸癌的發(fā)展起重要作用.【關鍵詞】 宮頸腫瘤;增殖細胞核抗原；明膠酶B；免疫組織化學0引言宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，其局部侵襲力強，易直接蔓延和經(jīng)過淋巴道轉移. 從原位癌增殖到侵襲轉移癌的演進過程,一方面依賴于腫瘤細胞本身的惡性潛能，另一方面是其實質與間質之間相互作用的結果. 增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）是DNA聚合酶的輔助因子，能反映細胞

7、增殖活性 . 基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9, MMP9)屬于基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）家族成員，能降解, ,型膠原及纖維粘連蛋白等基底膜和細胞外基質成分，從而促進惡性腫瘤的浸潤、轉移及間質血管新生；而間質血管新生則為腫瘤組織提供營養(yǎng)并排出其廢物，使腫瘤得以持續(xù)迅速生長和發(fā)生浸潤轉移 . 為進一步探討宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機理，我們應用免疫組織化學SP法檢測不同宮頸組織中MMP9和PCNA基因的表達，并討論其臨床意義.1對象和方法1.1對象200501/200602收治經(jīng)病理確診的活檢標本，年齡2770（

8、平均48.6）歲. 46例宮頸癌浸潤癌按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO， 1995）修訂的宮頸癌臨床分期標準，期28例，(60.9%)，期18例(39.1%). 按WHO病理分級標準分級：G16例(13.0%)；G228例(60.9%)；G312例(26.1%). 高、中、低分化相當于病理分級13級. 常規(guī)40 g/L甲醛固定、石蠟包埋，切片厚45 m. 以10例正常宮頸組織作對照.1.2方法鼠抗人MMP9抗體、小鼠抗大鼠PCNA抗體及通用型SP 9000試劑盒，山羊血清，生物素標記的二抗，抗辣根過氧化物酶標記的鏈霉素抗生素，二氨基聯(lián)苯胺顯色液購自武漢博士德生物技術有限公司產(chǎn)品. 一抗稀釋度均為13

9、0. MMP9和PCNA的免疫組織化學染色法按說明書進行操作，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化酶免疫染色（SP）法進行免疫組織化學染色，切片常規(guī)脫蠟水化后，于檸檬酸緩沖液中煮沸10 min，保溫10 min作抗原修復；PBS沖洗后山羊血清工作液孵育，滴加一抗37孵育2 h, PBS沖洗3次. 滴加二抗，PBS沖洗3次. 滴加三抗，孵育，PBS沖洗3次，DAB顯色，復染、脫水、透明、封片后鏡下觀察. 一抗以PBS為陰性對照. PCNA以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕褐色顆粒為陽性細胞，對每例切片進行細胞計數(shù),隨機取10個視野，記陽性細胞總數(shù)，用標記指數(shù)LI表示，即LI(%)（陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞）100，取

10、平均值定義為腫瘤的PCNA的LI3. MMP9蛋白定位于細胞質，陽性結果以胞質內出現(xiàn)黃色為準. 結果判定采用半定量積分法4，并根據(jù)每張切片的陽性細胞比例及著色深淺計分，著色細胞比例1p3以下為1分；1p3 2p3為2分 ；2p3以上為3分. 著色深度：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分. 根據(jù)兩者的乘積判斷陽性等級：0分為（-）；12分為（+）;34分為（） ；>4分為（）.統(tǒng)計學處理： 實驗結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，各指標間的相關采用Spearman相關分析法，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗, 兩組間表達率比較采用2檢驗，P<

11、0.05認為差異有統(tǒng)計學意義.2結果2.1PCNA蛋白表達PCNA免疫組化陽性細胞為胞核著色，46例宮頸組織中均有不同程度PCNA的陽性表達，PCNA標記指數(shù)為4.00%71.06%，在中、晚期惡性腫瘤組織中PCNA的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,分化程度越差，PCNA表達越高，但沒有統(tǒng)計學差異. 而PCNA的表達與年齡、生長方式無明顯相關性. 正常宮頸組織見PCNA極微弱陽性染色,10例正常組織PCNA標記指數(shù)不足5%（表1）.2.2MMP9蛋白表達MMP9免疫組化陽性的表達主要位于細胞的胞質和細胞膜，腫瘤細胞間質均呈均質性的弱陽性反應. MMP9陽性的癌細胞均呈灶狀或

12、片狀分布，且多位于癌邊緣. 宮頸癌組織多呈陽性、中度陽性表達. 正常宮頸組織MMP9表達多為陰性或弱陽性. MMP9在宮頸癌的表達率為82.61%，不同年齡組中的表達分別為87.50%（<49歲），72.72%（49歲）；在中、晚期患者中的表達分別為71.42%和100.00%；在低分化及中高分化的表達分別為83.33%，82.35%；在菜花型和結節(jié)型生長方式中的表達分別為93.75%，57.14%，其中在中、晚期患者中的表達有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與其余各項臨床病理參數(shù)均無統(tǒng)計學意義. 46例宮頸癌組織中兩者表達陽性者38例（82.61%），呈正相關（rs

13、=0.433, P=0.003）. 表146例患者PCNA和MMMP9的表達（略）aP<0.05 vs 期.3討論宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因、多因素及分子水平多階段的過程. 目前宮頸癌的發(fā)病率有上升趨勢，尤其年輕宮頸癌發(fā)生率上升趨勢更加明顯5. 增殖、浸潤和轉移是惡性腫瘤主要的生物學特征，也是影響治療效果和預后的主要因素.PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，屬于一種酸性核蛋白，參與DNA的合成并在細胞周期中起重要的調控作用. PCNA在DNA的合成的G1期開始增加，至S期達到高峰，G2/M期迅速降低. 這種變化恰好與細胞增殖周期過程相關. 由于PCNA的合成與表達和細胞增殖活性密切

14、相關，因此檢測PCNA可以反映癌細胞DNA的合成情況，為癌細胞增殖活性提供客觀指標. PCNA不僅在DNA復制中起關鍵作用，而且許多細胞內外增殖信號都須經(jīng)過PCNA的參與，才能引發(fā)細胞DNA合成及分裂增殖6. 研究發(fā)現(xiàn)，PCNA與許多惡性腫瘤如腦星形細胞瘤、宮頸癌、肝癌、乳腺癌等地病理分級、臨床分期及淋巴結或臟器轉移有關，并可用于臨床診斷、指導治療以及預后評估. 本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者PCNALI與正常宮頸組相比有顯著性差異（P<0.05），說明宮頸癌細胞有生長調節(jié)失控、DNA合成紊亂現(xiàn)象. 細胞的異常增殖對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起了重要作用，而與增殖相關基因的異常表達恰恰解釋了細胞的異常

15、增殖. 本研究中PCNA的陽性表達與宮頸癌的浸潤深度有關，分期越晚PCNA的表達越高. 這提示宮頸癌一旦浸潤轉移后，癌細胞增殖活性大大增加，惡性程度明顯增高. 本研究發(fā)現(xiàn)分化程度越低，PCNA的表達越高，這與文獻報道腫瘤細胞的分化程度越低，增殖指數(shù)增高，惡性越高相一致，但本研究未發(fā)現(xiàn)具有顯著性差異，可能與病例數(shù)較少有關.基質金屬蛋白酶(MMPs)活性與腫瘤浸潤轉移能力之間有著密切的關系. 腫瘤新生血管的形成過程中包括毛細血管內皮下層基底膜降解，內皮細胞遷移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列過程7. MMP9是MMPs中分子量最大的酶，是一類分解細胞外基質組分的鋅蛋白酶,它以酶原的形式

16、分泌，被激活后形成型膠原酶. 一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質和血管壁的基底膜，促進腫瘤侵襲和轉移，另一方面則通過毛細血管內生、新生血管生成促進腫瘤侵襲和轉移. 基質蛋白酶是高度保守的一類酶，可以特異降解腫瘤細胞外基質中的一種或幾種蛋白質，故可以降解所有的細胞外基質，由此MMPS降解細胞外基質是腫瘤細胞向瘤灶周圍侵襲性生長的關鍵事件8. 本研究發(fā)現(xiàn)在增長正常組織中MMP9呈低水平表達或陰性表達，而在腫瘤組織中呈陽性表達，且MMP9的表達量在兩者中有顯著差異（P<0.05）. 本研究發(fā)現(xiàn)PCNA, MMP9在宮頸癌組織中的表達中隨著病理分期越高表達指數(shù)明顯增高. 有關文獻報

17、道癌細胞MMP9表達增強與其增殖指數(shù)的增加有關，MMP9表達細胞增殖指數(shù)明顯高于陰性對照組，提示MMP9具有促進細胞增殖功能. PCNA蛋白檢測可直接反映細胞合成代謝及增殖狀態(tài) . 而MMP9基因調控主要在轉錄水平，多種MMP基因的增強子區(qū)域有高度的調控元件的保守性，由生長因子、細胞因子和環(huán)境因素誘導表達. 宮頸癌組織中MMP9表達與正常組織相比明顯增高，與細胞增殖關系密切，提示MMP9基因的激活可能通過促進腫瘤細胞增殖，以及降解細胞外基質和血管壁的基底膜促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展. 可以推測，兩者表達的宮頸癌細胞中，PCNA促進細胞的大量增殖，而MMP9能夠破壞細胞外基質，提供癌細胞的發(fā)展空間和轉移

18、通道，兩者相互協(xié)同，可能造成了宮頸癌易復發(fā)轉移的特征. 針對二者的靶向治療，則有可能阻斷宮頸癌的進程. 有關MMP9與PCNA對宮頸癌預后的關系需做進一步隨訪研究.【參考文獻】1 FernandezSanchez M, GamboaDominguez A, Uribe N, et al. Clinical and pathological predictors of the response to neoadjuvant anthracycline chemotherapy in locally advanced breast cancer J. Med Oncol, 2006,23(2):1

19、71-183.2 Rytkonen AK, Vaara M, Nethanel T, et al. Distinctive activities of DNA polymerases during human DNA replication J. FEBS J,2006,273(13):2984-3001.3 Nair A, Venkatraman M, Maliekal TT, et al. NFk is constitutively activated in high grade squamous in traeoithelial lesions and squamous cell carcinomas of the huaman uterine cervix J. Oncogen