第9章分子雜交技術

1、第九章分子雜交技術互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子 DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列 進行特異性的 靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組 DNA ,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提 純的，也可以在 細胞內雜交，即細胞原位雜交。 探針必須經過標記，以便示蹤和檢 測。使用最普遍的探針 標記物是同位素，但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許 多非同位素標記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因 而該技術在分子生物學領

2、域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制 作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用，而且在臨床診 斷上的應用也日趨增多。第一節(jié)核酸探針標記的方法核酸探針根據(jù)核酸的性質,可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標 記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針；根據(jù)是否存在互補鏈，可 分為單鏈和雙鏈探針；根據(jù)放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探 針。下面將介紹各 種類型的探針及標記方法。一、雙鏈DNA探針及其標記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于基因的鑒 定、臨床診斷等方面。雙鏈

3、DNA探針的合成方法主要有下列兩種：切口平移法和隨機引物合成法。1. 切口平移法（nick translation當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶I就可將核苷酸連接到切口的 3'羥基末端。同時該酶具有從5' -3的 核酸外切酶活 性，能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射 性的核苷酸，將放射性同 位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受 幾種因素的影響:(a產物的比活性取決于a32 PdNTP

4、的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b DNA酶I的用量和E.coliDNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應使用仔細純化后的DNA。材料:待標記的DNA o設備:高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(110 切口平移緩沖液：0.5mol/L Tris Cl (pH7.2; 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/LDTT; 100 卩 g/ml BSA(2未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外，其余3種分別溶 解于 50mmol/L Tris Cl(pH7.5 溶液中，濃度為 0.3mmol/L。(3 -32 P

5、 dCTP 或a32 PdATP:400 Ci/mmol, 10 卩 CiO l(4 E.coli DNA 聚合酶 I (4 單位 / 卩溶于 50 卩 g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘 油,50mmol/L Tris Cl(pH7.5 中。(5DNA 酶 I :1mg/ml。(6EDTA :200mmol/L (pH8.0。(710mol/L NH4Ac。操作步驟：(1按下列配比混合:未標記的dNTP 10卩110X切口平移緩沖液5卩1待標記的DNA Vga32 PdCTP 或 dATP(70 卩 Ci 7 卩1E.coli DNA聚合酶4單位DAN酶I 1卩1加水至終

6、體積50卩1(2置于15C水浴60分鐘。(3加入5卩l(xiāng) EDTA終止反應。(4反應液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀 回收DNA探針。注意1、3H , 32P及35S標記的dNTP都可使用于探針標記,但通常使用-32 P-dNTPo2、DNA酶I的活性不同 所得到的探針比活性也不同,DNA酶I活性高，則所 得探針比活性高，但長度比較短。2. 隨機引物合成法 隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產物的大小、 產量、比活性依賴于 反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為400-60

7、0個核苷酸。 利用隨機引物進行反應 的優(yōu)點是：(1Klenow片段沒有5' -3'外切酶活性，反應穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。(2反應時對模板的要求不嚴格，用微量制備的質粒DNA 模板也可進行反應。(3反應產物的比活性較高，可達4 X09 cpm/g探針。(4隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂 糖中直接進行。材料:待標記的DNA片段。設備:高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(1隨機引物(隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子 DNA。(210 隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6; 10mmol/L MgCI2。(3Klenow 片段。(420mmol/L DTT。

8、(5未標記的dNTP溶液:dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。(6 02 P dATP:比活性 >3000Ci/mmol, 10 卩 C。卩1(7 緩沖液 A :50mmol/L Tris Cl (pH7.5 ; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0 ;0.5% SDSo操作步驟：(1 200ng雙鏈DNA(1l和7.5ng隨機引物(1卩混合后置于eppendorf管內，水浴 煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。(2與此同時，盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物：20mmol/L DTT 1 卩1未標記的dN

9、TP溶液1卩110 >隨機標記緩沖液1卩1a32 P dATP（比活性 >3000Ci/mmol; 10 卩 Ci/ 卩 I 3 卩1ddH2O 1 卩1（3將步驟（1eppendof管中的溶液移到步驟（2管中。（4加入5單位（約1卩l(xiāng) Klenow片段,充分混合,在微型離心機中以12000g離心 1-2秒,使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3-16小時。（5在反應液中加入10卩緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20T下備 用。同時計算放射比活性。注意1、 引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產 物的累積較多；反之,則可獲得較長片段的探針。2、模板

10、DNA應是線性的，如為超螺旋DNA ,則標記效率不足50%。二、單鏈DNA探針用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣 DNA時,探針序列與被檢測序列間有很多錯 配。而 兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無效雜交，結果使檢測 效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩 種:（1以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針；（2以RNA為模板, 用反轉錄酶 合成單鏈cDNA探針。1. 從M13載體衍生序列合成單鏈 DNA探針合成單鏈DNA探針可將模板序列 克隆到噬?；騇13噬菌體載體中，以此為模板，以特定的通用引物或以人工合成的 寡合苷酸為引 物

11、,在a-32P-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標記探針 反應完畢后得到 部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長 短不一的產物，然后通過 變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 將探針與模板 分離開。雙鏈RF型M13 DNA也可用于單鏈DNA的制備，選用適當?shù)囊锛纯芍?備正鏈或負鏈單鏈探針。材料:已制備好的單鏈DNA模板(方法參見第十章中有關內容。設備:高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(110 Klenow 緩沖液:0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris CI(pH7：5; 0.1mol/L MgCI2。(20.1mol/L DTT 溶

12、液。(3 -32 P dATP:3000Ci/mmol, 10 卩 Ci/ 卩1(440mmol/L和20mmol/L的未標記的dNTP溶液。(5dCTP, dTTP , dGTP 各 20mmol/L 的溶液。(6 Klenow 片段(5 單位 /ml。(7適宜的限制酶，如EcoR I、Hi nd川等。(80.5mol/L EDTA (pH8.0。操作步驟：(1在0.5ml eppendof管中混合如下溶液：單鏈模板(約0.5pmol 1mg適當引物5pmol10>Kle now 緩沖液 3ml加水至20ml(2將eppendof管加熱到85C 5分鐘，在30分鐘內，使小離心管降到37

13、C ;(3依次加入：DTT 2mla-32PdATP 5ml未標記的dATP 1mldGTP , dCTP , dTTP 混合液 1ml混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。(4加1ml (5單位Klenow酶室溫下30分鐘。(5加1ml20mmol/L未標記的dA TP溶液20分鐘。(668C加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調整NaCI濃度,使之適宜于酶切。(7加入20單位限制性內切酶(如EcoR I , Hi nd川等酶切1小時。(8酚/氯仿抽提DNA ,乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0至終 濃度 10mmol/L。(9用電泳方法分離放射性標記的探針。2

14、. 從RNA合成單鏈cDNA探針cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相 應的基因。用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種：(1用寡聚dT為引物 合成cDNA探針。本方法只能用于帶 Poly(A的mRNA，并且產生的探針極大多數(shù) 偏向于mRNA 3'末端序列。(2可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述 缺點,產生比活性較高的探 針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子, 所得探針的序列往往比以克隆 DNA為模板所得的探針復雜得多，應預先盡量富集 mRNA中的目的序列。反轉錄得到的產物RNA/DNA雜交雙鏈經堿變性后，RNA單鏈可被迅速地降解 成小片段，經Se

15、phadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。材料：已提純的RNA或 mRNA設備:高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(1合適的引物：隨機引物或oligo(dT15-18。(25mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。(3 a-32PdCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml。(4反轉錄酶(200000單位/ml。(5100mmol/L DTT。(6250mmol/L MgCI2。(71mol/L KCl。(80.5mol/L EDTA (pH8.0。(910% SDS。(10RNasi n(40 單位 /ml。操作步驟:(1在已置于冰浴中的滅菌離心管中加

16、入下列試劑RNA 或 mRNA 10.0ml合適的產物(1mg/ml 10.0ml1mol/L Tris CI(pH7.6 2.5ml1moI/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCI2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0mla-32PdCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRn asi n 20U加水至48ml反轉錄酶(200000單位/ml 2ml混勻后，稍稍離心,37r保溫2小時。(2反應完畢后加入下列試劑:0.5mol/L EDTA (pH8.0 2ml 10% SDS 2ml(3加入3ml 3mol/L NaOH。 68C保溫30分鐘以水解 RN

17、A。(4冷卻至室溫后,加入10ml 1mol/L Tris Cl (pH7.4?；靹?。然后加入3ml 2mol/L HCl。(5酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉淀法分離標記的探針。注意RNA極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC處理后，滅菌備用。末端標記DNA探針現(xiàn)以Klenow片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。1、材料:待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。2、設備:高速臺式離心機，水浴鍋等。3、試劑：(13種不含標記的dNTP各為200mmol/L。(2合適的限制酶。(3 a2P dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul

18、。(4Klenow 片段(5U/ml。(510 末端標記緩沖液:0.5mol/L Tris Cl (pH7.2, 0.1mol/L MgS04, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。4、操作步驟：(125卩反應體系中用合適的限制酶酶切1 pg的DNA。(2按下列成分加入試劑并混勻：已酶切的DNA 1mg (25ml 10末端標記緩沖液5ml 2mmol/L 3 種 dNTP 1ml a-32P-dNTP 適量 加水至 50ml(3加入1單位的Klenow片段，室溫下反應30分鐘。(4加入1ml 2mmol/L第四種核苷酸溶液，室溫保溫15分鐘。(570C加熱5分鐘，終止反應。(

19、6用酚/氯仿抽提后，用乙醇沉淀來分離標記的 DNA ,或用Sephdadex G-50柱層析分離標記的DNA注意1、利用本方法可對DNA分子量標準進行標記，利用它可定位因片段太小而無 法在凝膠中觀察的DNA片段。2、對DNA的純度不很嚴格，少量制備的質粒也可進行末端標記合成探針。3、 末端標記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突 出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進行交換反應標記 5'末端。四、寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探 針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成

20、的寡 核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對，可以準確地設計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序 列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效。1、材料:待標記的寡核苷酸(10pmol/。2、設備:高速離式離心機，恒溫水浴鍋等。3、試劑：(110 X4 多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/L Tris Cl (pH7.6, 0.1mol/L MgCI2 , 50mmol/L DTT , 1mmol/L Spermidine HCI；1mmol/L EDTA (pH8.0。(2 Y2 P ATP(比活性 7000Ci/mmol; 10mCi/ml。

21、(3T4多核苷酸激酶(10單位/ml。4、操作步驟:(1100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65C變性5分鐘,迅速置冰溶中(2立即加入下列試劑：10 激酶緩沖液5mlg-32PATP(比活性 7000Ci/mmol; 10mCi/ml 10mlT4多核苷酸激酶2ml加水至50ml混勻后置37 E水浴20分鐘。(3再加入20單位T4多核苷酸激酶，置37T水浴20分鐘后立即置冰浴中。(4Sephadex G-50柱 層析。此方法是在每個探針的5'末端多加了一個磷酸，理論上,這會影響其與DNA的 雜交。因此，建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探 針。除了常見

22、的同位素標記探針外，還有利用非同位素標記探針和雜交的方法，許多 公司都有不同的非同位素標記探針的雜交系統(tǒng)出售，可根據(jù)這些公司所提供的操作 步驟進行探 針的標記和雜交。五、RNA探針許多載體如pBluescript , pGEM等均帶有來自噬菌體 SP6或E.coli噬菌體T7 或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于 DNA的RNA聚合酶 所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的 NTP ,則可合成RNA探針。RNA探針一般 都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點,又具有許多DNA單鏈探針 所沒有的優(yōu)點,主要是:RNA :DNA雜交體比DNA :DNA雜交體有更高的穩(wěn)

23、定性，所 以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產生信號要強。RNA :RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA :RNA雜交體容易控制，所以用 RNA探針進行RNA結構分析比用DNA探針效果好。噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的 dNTP濃度低，因而能在較低濃度放射性底物的存在下，合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉錄許多次，所以RNA的產量比單鏈DNA高。并且用來 合成RNA的模板能轉錄多次,可獲得比單鏈DNA更高產量的RNA。反應完畢后,用無RNA酶的DNA酶I處理,即可除去模板DNA ,而單鏈DNA 探針則需通過凝膠電

24、泳純化才能與模板 DNA分離。另外噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質粒 或真核生物的啟動子,對模板的要求也不高，故在異常位點起始RNA合成的比率很 低。因此,當將線性質粒和相應的依賴 DNA的RNA聚合酶及四種rNTP 一起保溫 時所有RNA的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈 DNA探針合成中若 模板中混雜其他DNA片段,則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合 成的探針是RNA ,它對RNase特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除 RNase另外如果載體沒有很好地酶切 則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA ,它 有可能帶上質粒的序列而降

25、低特異性。第二節(jié)幾種常見的雜交分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記 的探針與被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位 置。根據(jù)被測定的 對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：(1 Southern雜交:DNA片段經電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼 龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為 DNA ,探針為DNA或RNA 。(2 Northern雜交:RNA片段經電泳后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后 用探針雜交。被檢對象為RNA ,探針為DNA或RNA。根據(jù)雜交所用的方法，另外還有斑點(dot雜交、狹槽(slot雜交和菌落原位雜交

26、 等。有3種固相支持體可用于雜交：硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和 Whatman 541濾 紙。不同商標的 尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴格 按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度，最早用于篩選細 菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使 用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點：它更便宜,雜交中更耐用，干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變 性過程不小心，雜交信號的強度會明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此，常規(guī)的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸 纖維素濾

27、膜 作為固相支持體。一、Souther n 雜交Southern雜交可用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序 列,它包括下列步驟：(1酶切DNA ,凝膠電泳分離各酶切片段，然后使DNA原位變性。(2將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。(3預雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。(4讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結合的探針。(5通過顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素，包括目的DNA在總DNA中 所占的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條

28、件下，放射自顯影曝光數(shù)天后，Southern雜交能很 靈敏地檢測出低于O.lpg與32 P標記的高比活性探針的（109 cpm/卩互補DNA。 如果將10卩§基因組DNA轉移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，曝光 過夜，則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。將DNA從凝膠中轉移到固體支持物上的方法主要有3種:（1毛細管轉移。本方法由Southern發(fā)明，故又稱為Southern轉移（或印跡。毛細管轉移方法的優(yōu)點是簡 單，不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長，轉移后雜交信號較弱。（2電泳轉 移。將DNA變性后,可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點是不需要脫嘌呤

29、 冰解作用，可直接轉移較大 的DNA片段。缺點是轉移中電流較大，溫度難以控 制。通常只有當毛細管轉移和真空轉 移無效時，才采用電泳轉移。（3真空轉移。有 多種真空轉移的商品化儀器，它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面 的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上 面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中 的DNA ,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速,在30分鐘內就能從正常厚度（4- 5mm和正常瓊脂糖濃度（1%的凝膠中定量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比Southern轉移強2-3倍。缺點是如不小心,會使凝膠碎裂,并且在洗膜不嚴格時，其 背景比毛細轉移要高。1、材料:待檢測的DNA ,已

30、標記好的探針。2、設備：電泳儀，電泳槽,塑料盆，真空烤箱,放射自顯影盒,X-光片,雜交袋,硝酸 纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。3、試劑：（110mg/ml 溴化乙錠（EB。（250）Denhardt's溶液:5g Ficoll-40, 5g PVP , 5g BSA 加水至 500ml，過濾除菌后 于-20 r儲存。（31 ELOTTO :5g脫脂奶粉,0.02%疊氮鈉，儲于4C(4 預雜交溶液:6 ESC , 5 Denhardt , 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子 DNA , 50% 甲酰胺。(5雜交溶液:預雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。(60.2mol/L HCl

31、。(70.1% SDS。(80.4mol/L NaOH。(9 變性溶液：87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至 1000ml。(10 中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris Cl ,加水至 1000ml。(11硝酸纖維素濾膜。(1220 ESC :3mol/L NaCl, 0.3mol/L 檸檬酸鈉，用 1mol/L HCl 調節(jié) pH 至 7.0; (132 E 1 E 0.5、0.25 E 0.1 SSC 用 20 ESC 稀釋。4、操作步驟：(1約50卩體積中酶切10pg-10 yg勺DNA ,然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小 時(包括DNA分子量標準物。

32、(2 500ml水中加入25卩l(xiāng) 10mg/m溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鐘,然后 照相。(3依次用下列溶液處理凝膠，并輕微搖動:500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘,傾去溶 液(如果限制性片段10kb,酸處理時間為20分鐘，用水清洗數(shù)次，傾去溶液;500ml 變性溶液兩次,每次15分鐘，傾去溶液;500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜 雜交,本步可以省略。(4戴上手套，在盤中加20 ESC液，將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透，再用 20XSSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過 20>SSC液的3濾紙蓋住濾膜，然后加上干的3濾紙和干紙巾，

33、根據(jù)DNA復雜程度轉 移2-12小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉移時用0.4mol/L NaOH代替20 8SC。簡 單的印跡轉移2-3小時，對于基因組印跡，一般需要較長時 間的轉移。(5去除紙巾等，用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉移日期，做好記號,取出濾膜， 在2 SSC中洗5分鐘，涼干后在80C中烘烤2小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能 空氣干燥，不得烘烤。(6將濾膜放入含6-10ml預雜交液的密封小塑料袋中，將預雜交液加在袋的底部， 前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42E預雜交3-12小時，棄去 預雜交液。(7制備同位素標記探針(參見第一節(jié)，探針煮沸變

34、性5分鐘。(8在雜交液中加入探針，混勻。如步驟(6將混合液注入密封塑料袋中，在與預雜 交相同溫度下雜交6-12小時。(9取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動：在室溫下,1 SSC/0.1% SDS, 15分鐘，兩次。在雜交溫度下，0.25 SSC/0.1% SDS, 15分鐘，兩次。(10空氣干燥硝酸纖維素濾膜，然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可見 DNA譜帶。對于> 108 cpm/從缺口平移所得探針，可很容易地從10yg甫乳DNA 中檢測到10pg的單拷貝基因。二、Norther n 雜交Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為RNA ,其電

35、 泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構，保證RNA完全按分子大小分離。 變性電泳主要 有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上然 后與探針雜交。1、材料:待檢測的RNA及制備好的探針。2、設備：電泳儀，電泳槽,塑料盆，真空烤箱,放射自顯影盒,X-光片,雜交袋,硝酸 纖維素膜或尼龍膜。3、試劑：(120 ESPE :175.3g NaCl , 88.2g檸檬酸鈉，溶于 800ml 水中,用 10mol/LNaOH 調 pH至7.4定溶到1L。(2其他試劑：與Southern雜交試劑類似,只是

36、所有的試劑均應用 DEPC處理。4、操作步驟：(1RNA經變性電泳完畢后，可立即將乙醛酰RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。 轉移方法與轉移DNA的方法相似。(2轉移完畢后，以6 ESC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。(3將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80C干燥0.5-2小時。(4用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間為1-2小時。若于42C進行，應采用:50%甲酰胺,5 ESPE , 2 Denhardt's試劑,0.1% SDS;若于68C進行,應采用:6 ESSC , 2 Denhardt's試劑,0.1% SDS,注意:BLOTTO 不能用于 Norther

37、n 雜交。(5在預雜交液中加入變性的放射性標記探針，如欲檢測低豐度mRNA ,所用探針 的量至少為0.1卩其放射性比活度應大于2 >108 cpm份卩放在適宜的溫度條件下 雜交16-24小時。(6用1 SSC、0.1% SDS于室溫洗膜20分鐘,隨后用0.2 SSC、0.1% SDS于 68 T洗膜3次，每次20分鐘(7用X光片(Kodak XAR-2或與之相當?shù)漠a品 進行放射自顯影，附加增感屏于 -70°C曝光24-48小時。注意(1如果瓊脂糖濃度高于1%,或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于 2.5kb ,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘，部分水解R

38、NA并提高轉移效率。 浸泡后用經DEPC處理的水淋洗凝膠，并用20 >SSC浸泡凝膠45分鐘。然后再轉移到濾膜上。(2在步驟(3的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰 RNA ,雜交前需用20mmol/LTris Cl(pH8.0于65C洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。(3RNA自凝膠轉移至尼龍膜所用方法，與RNA轉移至硝酸纖維素濾膜所用方 法類似。(4含甲醛的凝膠在RNA轉移前需用經DEPC處理的水淋洗數(shù)次，以除去甲醛。 當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能 力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰 RNA ,同時可部分水解RNA , 并

39、提高較長RNA分子(>2.3kb轉移的速度和效率。此外，堿可以除去mRNA分子的 乙二醛加合物，免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA在堿性條件下轉移至帶正電 荷尼龍膜的操作也按DNA轉移的方法進行，但轉移緩沖液為7.5mmol/LNaOH,轉移 結束后(4.5-6.0小時，尼龍膜需用2 >SC、0.1%SDS淋洗片刻、于室溫晾干。(5尼龍膜的不足之處是背景較高，用RNA探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置于 高濃度的堿性溶液中，會導致雜交背景明顯升高，可通過提高預雜交和雜交步驟中有 關阻斷試劑的量來予以解決。(6如用中性緩沖液進行RNA轉移,轉移結束后，將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙 中間，8

40、0C干烤0.5-2小時，或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶 RNA的一面。 后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用，因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理后雜交信號可以增 強。然而為獲得最佳效果，務必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射 可促進RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結構，而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價結合于尼龍膜表面，導致雜交信號減弱。三、菌落原位雜交對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(100-200進行克隆篩選時，可采用本方 法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝 酸纖維素濾膜 上。經培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板

41、應貯存于 4C 直至得到篩選結果。1、材料:待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。2、設備:恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。3、試劑：(1LB固體培養(yǎng)基。(20.5mol/L NaOH。(31mol/L Tris Cl (41.5mol/L NaCl。(50.5mol/L Tris Cl (6 預洗液:5 ESC , 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0。(7預雜交液:50%甲酰胺，6 SSC或6 :SSPE , 0.05 BEOTTO(甲酰胺可不用。(8其余試劑:與 Southern雜交相同。4、操作步驟:1.將少數(shù)菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上(1在含有

42、選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。(2用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上，再轉移至含有選擇性抗生素但未放 濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種 (或打點。每菌落應分別劃 線于兩個平板 的相同位置上。最后,在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒 (如pBR322的菌落。(3倒置平板，于37C培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到 0.5-1.0mm的寬度。(4用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。(5用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4°C ,直至獲得雜交反應的結果。(6裂解細菌，按本段

43、下面所述方法，使釋放的DNA結合于硝酸纖維素濾膜。2.菌落的裂解及DNA結合于硝酸纖維素濾膜(1在一張保鮮膜上制作一個裝有 0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml,使菌落面朝上, 將濾膜放到小洼上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘。(2用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復步驟(1。(3吸干濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris Cl(pH7.4的保鮮膜洼上。5分 鐘后吸干濾膜,再重復一次該步驟。(4吸干濾膜，把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris Cl (pH7.4的保鮮膜小 洼

44、上5分鐘后吸干濾膜，轉移到一張干的濾紙上，置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。(5將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80C干烤2小時，固定DNA(6將固定在膜上的DNA與32 P標記的探針雜交。5. 雜交(1盛有2 ESC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上，徹底浸濕5分鐘。(2將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放于溶液中。用保 鮮膜蓋住玻璃皿，放到位于培養(yǎng)箱內的旋轉平臺上。于 50°C處理30分鐘。在這一 步及以后的 所有步驟中，應緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起。(3用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，以降低雜交背景而 不影響陽性雜交信號的

45、強度和清晰度。(4將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中，在適宜溫度(即在水溶液中雜交時 用68C,而在50%甲酰胺中雜交時用42C下,預雜交1-2小時。(5將32 P標記的雙鏈DNA探針于100C加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。 單鏈 探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發(fā)。(6雜交結束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積(300- 500ml 的 2 ESC 和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗一次，同時 應避免膜干涸。(768C用300-500ml 1 SEC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5

46、小時。此時 已可進 行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml0.2 ESC和0.1% SDS的溶液于68C將濾膜浸泡60分鐘。(8把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后，把濾膜(編號面朝上 放在一張保鮮膜上，并 在保鮮膜上作幾個不對稱的標記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。(9用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加 X光片并加上增感屏于-70 C曝光12-16小 時。(10底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分布點的位置上作出標記?？蓮牡灼先∠峦该骷?，通過對比紙上的點與瓊脂 上的點來鑒定陽性菌落。四、斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA

47、樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探 針分子 雜交,以顯示樣品中是否存在特異的 DNA或RNA。同一種樣品經不同倍數(shù) 的稀釋，還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因診斷中經常用到，是研究基因表達的有力工具。 但由于目的序列未與非目的 序列分離，不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾 較高時，難以區(qū)分目的序列信號和 干擾信號。1、材料:待分析的DNA或RNA樣品已標記的探針。2、設備:狹槽點樣器,真空泵，恒溫水浴,真空烤箱等。3、試劑：(1 100%甲酰胺。(2 甲醛(37%。(3 20 SSC。(4 0.1mol/L NaOH。(5