微生物的計數(shù)——血球計數(shù)板法

1、微生物得計數(shù)一一血球計數(shù)板法【摘要】 測定微生物細胞數(shù)量得方法很多，有分光光度法、顯微直接計數(shù)法 與平板計數(shù)法。分光光度法比較簡便，易操作，但就是會使數(shù)據(jù)嚴重偏大。而平 板計數(shù)法則會使實驗數(shù)據(jù)嚴重偏小.？ 顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體 得純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨.菌體較大得酵母菌或霉菌抱子可 采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫霍澤（Pet r o f Hauss e r）細菌 計數(shù)板。兩種計數(shù)板得原理與部件相同，只就是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部得細菌不易瞧滿.本實驗采 用血球計數(shù)板法，主要目得就是了解血球計數(shù)板法得構(gòu)造與

2、使用方法， 學(xué)會用血 球計數(shù)板對酵母菌細胞進行計數(shù)。一、實驗?zāi)康门c要求1、了解微生物計數(shù)常用得三種方法：分光光度法；平板計數(shù)法；血球計數(shù)板法。2、了解血球計數(shù)板得構(gòu)造與使用方法。3、學(xué)會用血球計數(shù)板對酵母細胞進行計數(shù)。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，就是一種常用得微生物計數(shù)方法。此 法得優(yōu)點就是直觀、快速.將經(jīng)過適當稀釋得菌懸液（或抱子懸液）放在血球計 數(shù)板載玻片與蓋玻片之間得計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室得容積 就是一定得（0、1mn2）,所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到得微生物數(shù)目來換算 成單位體積內(nèi)得微生物總數(shù)目。由于此法計得得就是活菌體與死菌體得總與， 故 又稱為總

3、菌計數(shù)法.血球計數(shù)板，通常就是一塊特制得載玻片，具上由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間 得平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊得平臺上各刻有一個方格網(wǎng) ，每個方格網(wǎng) 共分九個大方格，中問得大方格即為計數(shù)室，微生物得計數(shù)就在計數(shù)室中進行。計數(shù)室得刻度一般有兩種規(guī)格，一種就是一個大方格分成1 6個中方格， 而每個中方格又分成25個小方格；另一種就是一個大方格分成25個中方格，而 每個中方格又分成16個小方格。但無論就是哪種規(guī)格得計數(shù)板，每一個大方格中得小方格數(shù)都就是相同得，即1 6 X 25=400小方格。A.正1 Hr16X25和25X16睥種模耕實蕤圖 6血球計效板的構(gòu)造每一個大方格邊長為1 mm則每一大

4、方格得面積為1 m吊，蓋上蓋玻片后, 載玻片與蓋玻片之間得高度為 0.1mm所以計數(shù)室得容積為0 .1 mm30在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格得總菌數(shù)，然后求得每個中方格得平均值，再 乘上16或25,就得出一個大方格中得總菌數(shù)，然后再換算成 1ml菌液中得總菌 數(shù).下面以一個大方格有2 5個中方格得計數(shù)板為例進行計算： 設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A,菌液稀釋倍數(shù)為B,那么，一個大方格中得總菌數(shù)一.3 3因 1ml=1cm = 1000mm,= 50 0 0 0A B （個）同理，如果就是16個中方格得計數(shù)板，設(shè)五個中方格得總菌數(shù)為 A',則三、實驗材料1）菌種：釀酒酵母菌2）用品：顯微鏡、血球

5、計數(shù)板、酒精燈、蓋玻片、接種環(huán)、番紅染液、膠 頭滴管。四、實驗方法1、實驗流程圖制備稀釋液一加樣一找計數(shù)室一計數(shù)2、實驗步驟1）鏡檢計數(shù)室：在加樣前，先對計數(shù)板得計數(shù)室進行鏡檢。若有污物 ，則需清洗 后才能進行計數(shù).2）將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃 ，可不必稀釋。3）取潔凈得血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。然后在顯微鏡下 找到計數(shù)室。若計數(shù)室沾有雜質(zhì)或者菌體，要用蒸儲水沖洗計數(shù)板 ，用濾紙吸干 其上得水分。然后再放到顯微鏡下找到計數(shù)室。4）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)得溝槽內(nèi)沿蓋 玻片得下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體得表面張力充滿

6、計數(shù) 區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出得多余菌懸液.5）靜置片刻，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生 活細胞得折光率與水得折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照得強度.6）計數(shù)時若計數(shù)區(qū)就是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、 右上、右下得4個大方格（即100小格）得菌數(shù)。如果就是25個大方格組成得計 數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格得菌數(shù)（即80個小格）。 如菌體位于大方格得雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線 ，數(shù)左線不數(shù)右線，以減 少誤差.本實驗采用2 5格X 1 6格得血球計數(shù)板。計數(shù)時應(yīng)數(shù)5個大方格。7 ）計數(shù).每個樣品重復(fù)計數(shù)2 3次（每

7、次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操 作），求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N）,按公式計算出每 ml（ g）菌懸液所含酵 母菌細胞數(shù)量。8 ）測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹 擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內(nèi)保存.9）計算結(jié)果?？捎靡韵鹿竭M行計算(1)1 6格X25格得血球計數(shù)板計算公式：堂田胞數(shù)/ml= 1 00小格內(nèi)細胞個數(shù)/100X40 0 X 100 00X稀釋倍數(shù)(2) 25格X 16格得血球計數(shù)板計算公式：細胞數(shù)/ml= 8 0小格內(nèi)細胞個數(shù)/80 X40 0 X 1000 0X稀釋倍數(shù)五、實驗結(jié)果計 算 次 數(shù)各大格中細胞

8、數(shù)大格中 細胞總 數(shù)稀釋 倍數(shù)總菌數(shù)(CFU/mL 或g)左上右上左下右下中問弟一次323 749 600 0 0000六、結(jié)論與分析1、誤差來源本次試驗中我們組用得就是2號酵母培養(yǎng)液，就是本次試驗所用得酵母培養(yǎng)液中 濃度最高得培養(yǎng)液。但就是經(jīng)過老師分析，實驗數(shù)據(jù)仍然偏大得一點.產(chǎn)生這種誤 差得原因大概如下：酵母細胞計數(shù)得誤差分別來源于技術(shù)誤差與固有誤差.其中由于操作人員 不注意細節(jié)，器材處理、使用不當，稀釋不準確 ，細胞識別錯誤等因素所造成得 誤差屬技術(shù)誤差；而由于儀器(計數(shù)板、蓋片、吸管等)不夠準確與精密帶來得誤 差稱儀器誤差，由于細胞分布不均勻等因素帶來得細胞計數(shù)誤差屬于分布誤差或 計數(shù)

9、域誤差()。由于時間得關(guān)系，實驗計數(shù)得次數(shù)太少，難以得到準確均勻得實驗數(shù)據(jù)。 在實驗過程中，操作人員也存在一定得不嚴謹性，導(dǎo)致實驗結(jié)果產(chǎn)生誤差。由于沒 有足夠多得平行數(shù)據(jù)，難以用科學(xué)得計數(shù)方法進行結(jié)果得計算，因此難以得到比 較準確得實驗數(shù)據(jù)。因此，搞好酵母細胞計數(shù)得質(zhì)量控制一般需采用以下措施。1?）避免技術(shù)誤差，糾正儀器誤差？®所用器材均應(yīng)清潔干燥，計數(shù)板、血蓋片、微量吸管及 刻度吸管得規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正。嚴格操作，從消毒、稀釋、加樣到計數(shù)都應(yīng)規(guī)范，尤其應(yīng)注意得就是樣品稀釋 要作到充分混勻.必須一次性充滿計數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細胞懸液得量以不超過計數(shù)室臺面與蓋玻片之間得矩形

10、邊緣為宜。 2?）縮小計數(shù)域誤差或分布誤差由于血細胞在充入計數(shù)室后呈隨機分布或，而我們所能計數(shù)得細胞分布范圍就 是有限得，由此造成得計數(shù)誤差稱為計數(shù)域誤差或分布誤差?？s小這種誤差得有 效方法就就是盡量擴大細胞計數(shù)范圍與計數(shù)數(shù)目，一般先進行誤差估計，然后決 定所需計數(shù)得數(shù)目與計數(shù)范圍，只要能將誤差控制在允許范圍內(nèi)即可。2、不足之處血球計數(shù)板在顯微鏡下直接進行測定。它觀察在一定得容積中得微生物得 個體數(shù)目，然后推算出含菌數(shù)，簡便快捷。但就是在計數(shù)時包括死活細胞均被計 算在內(nèi)，還有微小雜物也被計算在內(nèi).這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對形態(tài) 個體較大得菌體或抱子進行計數(shù)。七、思考題1、試述血球計數(shù)板得計數(shù)原理。為什么用兩種規(guī)格不同得計數(shù)板計數(shù)同一樣品， 結(jié)果就是一樣得？答:每塊計數(shù)板由H形凹槽分為2個同樣得計數(shù)池 計數(shù)池兩側(cè)各有一支持 柱，將特制得專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0、10m m得計數(shù)池。計數(shù)池畫有長、 寬各3、0 mn#方格，分為9個大方格，每個大格面積為 1、0mm;容積為0、 1mm,中央大方格用雙線分成25個中方格，位于正中及四角5個