(完整版)分子生物學(xué)與基因工程

1、緒論 分子生物學(xué) 廣義： 研究蛋白質(zhì)及核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)和功能， 也就是從分子水平闡明生 命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律。狹義： 研究生物體主要遺傳物質(zhì)基因或DNA的結(jié)構(gòu)及其復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄、 表達(dá)和調(diào)節(jié)控制等過(guò)程的科學(xué)。基因工程：是指將一種或多種生物體的基因或基因組提取出來(lái) , 或者人工合成的基因 , 按照 人們的愿望 , 進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì) , 經(jīng)過(guò)體外加工重組 , 通過(guò)一定的方法 , 轉(zhuǎn)移到另一種生物 體的細(xì)胞內(nèi) , 使之能在受體細(xì)胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。里程碑事件： 1944 年， Avery 在肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了 DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)， 標(biāo)志 著分子生物學(xué)的誕生。1953年， Wat

2、son和Crick 提出 DNA雙螺旋模型，為分子生物學(xué)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 1961 年，法國(guó)科學(xué)家 Jacob 和 Monod提出了乳糖操縱子模型。1972年， Berg 構(gòu)建了世界上第一個(gè)重組 DNA分子，開(kāi)辟了生物學(xué)新領(lǐng)域遺傳工程。 1983 年， Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）技術(shù)，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。90 年代，開(kāi)展了“人類基因組計(jì)劃”和模式生物的基因組測(cè)序，分子生物學(xué)進(jìn)入“基因組 時(shí)代”。目前，分子生物學(xué)進(jìn)入了“后基因組時(shí)代”或“蛋白質(zhì)組時(shí)代” 。第二講核酸的化學(xué)成分： 核酸是一種高分子的化合物， 它的構(gòu)成單元是核苷酸， 核苷酸分子由三個(gè)部分組成：堿

3、基：嘧啶、嘌呤 五碳糖：核糖或脫氧核糖是核苷酸的多聚體。核苷核苷酸脫氧核糖核酸（ DNA）和核糖核酸（ RNA）（1）DNA含的糖分子是脫氧核糖， RNA含的是核糖；（2）DNA含有的堿基是腺嘌呤（ A）、胞嘧啶（ C）、鳥(niǎo)嘌呤（ G）和胸腺嘧啶（ T）， RNA含有 的堿基前 3 個(gè)與 DNA完全相同，只有最后一個(gè)胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是雙鏈，而 RNA主要為單鏈；（4）DNA的分子鏈一般較長(zhǎng)，而 RNA分子鏈較短。核酸的分布： 真核生物的絕大部分 DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色體上， 它是構(gòu)成染色體的主要 成分之一，還有少量的 DNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體、線粒體等細(xì)

4、胞器內(nèi)。RNA 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有，核內(nèi)則更多地集中在核仁上，少量在染色體上。細(xì)菌也含有DNA 和 RNA；多數(shù)噬菌體只有 DNA ；多數(shù)植物病毒只有 RNA；動(dòng)物病毒有些含有 RNA，有些含有 DNA 。 間接證據(jù)：（ 1）一種生物不同組織的細(xì)胞，不論年齡大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖細(xì)胞精子的 DNA含量則剛好是體細(xì)胞的一半。 多倍體生物細(xì)胞的 DNA含量是按其 染色體倍數(shù)性的增加而遞增的，但細(xì)胞核里的蛋白質(zhì)并沒(méi)有相似的分布規(guī)律。（2）DNA在代謝上較穩(wěn)定。（3）DNA是所有生物的染色體所共有的，而某些生物的染色體上則沒(méi)有蛋白質(zhì)。（4）DNA通常只存在于細(xì)胞核染色體上，

5、但某些能自體復(fù)制的細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體 有其自己的 DNA。（5）在各類生物中能引起 DNA結(jié)構(gòu)改變的化學(xué)物質(zhì)都可引起基因突變。 直接證據(jù)： 肺炎鏈球菌試驗(yàn)；噬菌體侵染實(shí)驗(yàn)；煙草花葉病毒侵染煙草實(shí)驗(yàn)（RNA）DNA結(jié)構(gòu)： 多核苷酸鏈片段（一級(jí)） ；雙螺旋結(jié)構(gòu)（二級(jí)）（1）兩條多核苷酸鏈以右手螺旋的形式彼此以一定的空間距離，平行地環(huán)繞于同一軸上；5' 3'方向，而另一條為2）兩條多核苷酸鏈走向?yàn)榉聪蚱叫?，即一條鏈磷酸二酯鍵為 3'一 5'方向，二者剛好相反； （3）每條長(zhǎng)鏈的內(nèi)側(cè)是扁平的盤(pán)狀堿基，堿基一方面與脫氧核糖相聯(lián)系，另一方面通過(guò)氫 鍵與它互補(bǔ)的堿基相聯(lián)

6、系。 互補(bǔ)堿基對(duì) A與T之間形成兩對(duì)氫鍵， 而 C與 G之間形成三對(duì)氫 鍵。上下堿基對(duì)之間的距離為 0.34nm；（ 4）每個(gè)螺旋為 3.4nm 長(zhǎng)，剛好含有 10 個(gè)堿基對(duì)，其直徑約為 2nm；（5）在雙螺旋分子的表面大溝和小溝交替出現(xiàn)。維持雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的力： （ 1）氫鍵（ 2）疏水作用堿基堆集力（ 3）范德華力（ 4） 磷酸基的負(fù)電荷靜電斥力（ 5）堿基分子內(nèi)能Tm：是指吸收值增加的中點(diǎn)。 影響因素： 1）DNA序列中 G + C 的含量或比例，含量越高， Tm值也越大（決定性因素） ； 2 ）溶液的離子強(qiáng)度； 3 ）核酸分子的長(zhǎng)度有關(guān)：核酸分子越 長(zhǎng)， Tm值越大； 4 ）某些化學(xué)

7、物質(zhì)； 5）溶液 pH值Z-DNA是左手螺旋，每個(gè)螺旋含 12 個(gè)堿基對(duì)，比 A-DNA擰得更緊 ; 雙螺旋中不存在深溝，只 有淺溝DNA的精細(xì)結(jié)構(gòu)（1）依賴于序列的 B-DNA 構(gòu)象變化：雙螺旋的許多結(jié)構(gòu)參數(shù)是隨堿基序列的不同而在一定 范圍內(nèi)變化的， 這稱為 DNA的局部構(gòu)象。 在 DNA中，隨堿基序列的不同而變化的參數(shù)有許多， 其中重要的有 螺旋扭轉(zhuǎn)角、螺旋槳扭角、 堿基對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)角 等，此外堿基對(duì)間還會(huì)發(fā)生滑動(dòng)。以 上這些變化使 DNA形成了精細(xì)結(jié)構(gòu)。 而精細(xì)結(jié)構(gòu)正是 DNA發(fā)揮功能時(shí)， 相應(yīng)蛋白質(zhì)因子與靶 位點(diǎn)作專一性識(shí)別和結(jié)合的標(biāo)志。（2）連續(xù) AT 序列的構(gòu)象；（3）含錯(cuò)配堿基對(duì)的 B

8、-DNA；（4）DNA的局部構(gòu)象與 DNA結(jié)合蛋白：各種酶（如 DNA聚合酶、 RNA聚合酶等）；調(diào)節(jié)蛋白 （如 CAP，Cro 阻遏物等）；這些蛋白質(zhì)與 DNA的結(jié)合涉及到生物學(xué)中的一些基本問(wèn)題， 如遺 傳和個(gè)體發(fā)育等，因此，核酸 - 蛋白質(zhì)交互作用已成為分子生物學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)（此處含有一道大題，詳見(jiàn)平時(shí)的作業(yè)本） DNA結(jié)構(gòu)的變化可以用數(shù)學(xué)式來(lái)表述：L = T WL 稱為 DNA的連接數(shù)； T 稱為盤(pán)繞數(shù)； W為超盤(pán)繞數(shù)。天然的 DNA都呈負(fù)超螺旋， 但在體外可得正超螺旋環(huán)形 DNA分子會(huì)由超螺旋化而變得更為致密， 它們?cè)?超離心 中的沉降速度和在 凝膠電泳 中的

9、 遷移速度都增加，故超螺旋 DNA可通過(guò)這兩種方法來(lái)檢測(cè)和分離。拓?fù)洚悩?gòu)酶 含義：指細(xì)胞內(nèi)存在著一類能催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)化的酶DNA中的不尋常結(jié)構(gòu)： 交替的嘧啶、嘌呤重復(fù)序列傾向形成Z-DNA；反向重復(fù)序列傾向形成十字形結(jié)構(gòu)；構(gòu)成 鏡像重復(fù) 的同型嘧啶 -同型嘌呤序列可能形成 三鏈結(jié)構(gòu)（ T-A-T; C-G-C ）； 富含 G 的序列可能形成 四鏈結(jié)構(gòu)（端粒酶） G-GG-Gk對(duì) DNA具有特征性，它與 DNA的堿基對(duì)數(shù)目成反相關(guān)，因此，Cot 曲線提供了一種測(cè)定DNA分子量的方法。 Cot 曲線也揭示單一來(lái)源的 DNA所具有的不同復(fù)雜性部分。 Southern 雜交鑒別 DNA第三

10、講 染色體的結(jié)構(gòu)特征 : 染色體是由染色質(zhì)構(gòu)成的， 染色質(zhì)是由 DNA、RNA和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體。 組蛋白在進(jìn)化中是保守的；組蛋白在翻譯后是受到修飾的，其中包括特異精、組、賴、絲和 蘇氨酸殘基的甲基化、乙?；土姿峄?。染色質(zhì)基本單位核小體。核小體由約 200 bp 的 DNA和 H2A，H2BH3 及 H4 各 2 分子所組成。 念珠狀。C值的含義： 在真核生物中，每種生物的單倍體基因組的DNA總量是恒定的，稱之為 C 值，它是每種生物的一個(gè)特性，不同物種的 C 值差別很大。C 值悖理： 一般認(rèn)為，一個(gè)生物的形態(tài)學(xué)復(fù)雜性應(yīng)該與其C 值的大小大致相關(guān)，但是， C 值和進(jìn)化之間的復(fù)雜性并沒(méi)有嚴(yán)

11、格的相應(yīng)關(guān)系。DNA的形狀與大小： DNA一般為長(zhǎng)而無(wú)分支的雙股線性分子，但有些為環(huán)型，也有少數(shù)為單 股環(huán)型。不同的 DNA大小相差懸殊。雖然一般而言，復(fù)雜的有機(jī)體需要更多的DNA，但不存在嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系。DNA的序列組織： 真核生物 DNA堿基組成上的異質(zhì)性主要由于存在著以下3類 DNA序列： 高度重復(fù)序列 （衛(wèi)星 DNA；微衛(wèi)星 DNA：Alu 家族）；中度重復(fù)序列 （中度重復(fù)序列包括 rRNA 和組蛋白基因， 每一基因組約含 1000 拷貝）；單一序列 （包括酶在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)基因） 。 簡(jiǎn)述真核生物基因組特點(diǎn)（ 此處含有一個(gè)問(wèn)答大題，詳見(jiàn)平時(shí)的作業(yè)本 ）第四講丙氨酸AlaA精氨酸Arg

12、R天冬酰氨AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸IleI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV蛋白質(zhì)概述： 蛋白質(zhì)是由 20 種左右的 -氨基酸通過(guò)肽鍵相互連接而成的一類具有特定的空 間構(gòu)象和生物學(xué)功能的高分子有機(jī)化合物。螺旋和雙螺旋的異同點(diǎn)（ 此處含有一個(gè)簡(jiǎn)答題，詳見(jiàn)平時(shí)作業(yè) ） 蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系： 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)； 一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)， 其 基本構(gòu)象及功能也相似； 在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中， 參與功

13、能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基， 即使在整個(gè)分子中發(fā)生一個(gè)殘基的異常， 那么該蛋白質(zhì)的功能也會(huì)受到明 顯的影響“分子病”的鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血僅僅是 574 個(gè)氨基酸殘基中，一個(gè)氨基酸 殘基即亞基 N 端的第 6 號(hào)氨基酸殘基發(fā)生了變異所造成的，這種變異來(lái)源于基因上遺傳 信息的突變；蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)。（ 此處含有一個(gè)簡(jiǎn)答題，詳見(jiàn)平時(shí)作業(yè)） 蛋白質(zhì)的別構(gòu)效應(yīng)： 在生物體內(nèi)， 當(dāng)某種物質(zhì)特異地與蛋白質(zhì)分子的某個(gè)部位結(jié)合， 觸發(fā)該 蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生一定變化，從而導(dǎo)致其功能活性的變化。第五、六講DNA 、RNA 合成：（ 分析題 ）SSBP ：?jiǎn)捂溄Y(jié)合蛋白 半保留復(fù)制：

14、DNA 在復(fù)制時(shí)首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂使兩條鏈分開(kāi)，然后以每一條鏈分 別做模板各自合成一條新的 DNA 鏈，這樣新合成的子代 DNA 分子中一條鏈來(lái)自親代 DNA ， 另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。（ 名詞解釋 ）半不連續(xù)復(fù)制： DNA 復(fù)制時(shí)，兩條鏈分別作模板，有一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，這條鏈稱為前 導(dǎo)鏈；而另一條鏈合成時(shí)， 只能以 5 ' 3 '先合成岡崎片段，然后利用 DNA 連接酶將各 個(gè)片段連接起來(lái)形成隨從鏈。 （名詞解釋 ） 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄： RNA 的轉(zhuǎn)錄合成是以 DNA 的一條鏈為模板而進(jìn)行的， 這種轉(zhuǎn)錄方式又叫做不 對(duì)稱轉(zhuǎn)錄（ 名詞解釋 ） 解釋復(fù)制

15、方向 5 3： RNA 聚合酶在 DNA 復(fù)制起始處做為引物，它們的 3 OH 末 端提供了由 DNA 聚合酶催化形成 DNA 分子第一個(gè)磷酸二酯鍵的位置。 DNA 聚合酶催化 dNTP 加到引物的 3OH 末端，因而 DNA 合成的方向是 5 3 （簡(jiǎn)答題 ） DNA 復(fù)制過(guò)程中的酶： 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I DNA 解鏈酶 引物酶 DNA 聚合酶 I DNA 聚合 酶 III / DNA 連接酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶 II （ 填空題 ）DNA 復(fù)制時(shí)，先由拓?fù)洚悩?gòu)酶作用于 DNA 雙螺旋分子，使之松弛，然后由 DNA 解鏈 酶作用，解開(kāi)雙鏈，此時(shí)在引發(fā)酶的作用下合成一段 RNA 作為引物，在 DNA po

16、l III 的聚合 作用下連續(xù)地合成前導(dǎo)鏈； 隨從鏈的合成依靠多種酶與蛋白質(zhì)因子的參與： 首先在引發(fā)酶的 作用下合成 RNA 引物，然后在 DNA pol III 的聚合作用下合成 DNA 片段，它們共同形成岡 崎片段。 RNA引物是靠 DNA 聚合酶 I進(jìn)行切割的，并由 DNA聚合酶 I填補(bǔ)RNA 引物切除 后留下的空隙，最后由 DNA 連接酶形成一條完整的鏈。DNA 復(fù)制的準(zhǔn)確性很高， 在原核生物中主要依靠 DNA 聚合酶 I 的外切活性來(lái)校正復(fù)制 過(guò)程中的堿基錯(cuò)配，而真核生物則依靠 DNA 聚合酶來(lái)完成。在真核生物中， DNA 復(fù)制一般有多個(gè)起始點(diǎn)，主要依靠 DNA 聚合酶 和 來(lái)完成，

17、 另外還需要 PCNA 等多種蛋白質(zhì)因子參與。DDRP ：轉(zhuǎn)錄也是一種酶促的核苷酸聚合過(guò)程，所需的酶叫做 依賴 DNA 的 RNA 聚合 酶。DDRP ： 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶 。第七講 參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)基礎(chǔ)： （ 1）合成原料。自然界由 mRNA 編碼的氨基酸共有 20 種，只有這些氨基酸能夠作為蛋白質(zhì)生物合成的直接原料。（2 ）mRNA 是合成蛋白質(zhì)的直接模板。 mRNA 以它分子中的核苷酸排列順序攜帶從 DNA 傳遞來(lái)的遺傳信息， 作為蛋白 質(zhì)生物合成的直接模板，決定蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。（3） tRNA 是氨基酸的運(yùn)載工具。 tRNA 是一類小分子 RNA

18、，長(zhǎng)度為 73-94 個(gè)核苷酸， tRNA 分子中富含 稀有堿基 和修飾堿基 ，tRNA 分子 3'端均為 CCA 序列，氨基酸分子通過(guò)共價(jià)鍵與 A 結(jié)合，此處的結(jié)構(gòu)也叫 氨基酸臂 。 tRNA 分子中還有一個(gè) 反密碼環(huán) （4）核糖體蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所（5）蛋白質(zhì)生物合成的必需因子。起始因子（IF）。延長(zhǎng)因子（ EF ）。釋放因子（ RF ）。1968 霍利 柯拉那 尼倫伯格 遺傳密碼的特點(diǎn)： （1）起始碼（ 2）終止碼 （ 3）密碼無(wú)標(biāo)點(diǎn)符號(hào) （ 4）密碼的兼并性。 一 種氨基酸有幾組密碼子， 或者幾組密碼子代表一種氨基酸的現(xiàn)象稱為密碼子的兼并性， 這種 簡(jiǎn)并性主要是由于密碼子的第三個(gè)

19、堿基發(fā)生擺動(dòng)現(xiàn)象形成的， 也就是說(shuō)密碼子的專一性主要 由前兩個(gè)堿基決定， 即使第三個(gè)堿基發(fā)生突變也能翻譯出正確的氨基酸， 這對(duì)于保證物種的 穩(wěn)定性有一定意義。如： GCU ， GCC ， GCA ，GCG 都代表丙氨酸。 （ 5）密碼的通用性 核糖體作為合成場(chǎng)所的原因： （ 解釋，分析，簡(jiǎn)答 ） 任何生物的核糖體都是由大、小兩個(gè)亞基組成。 （ 1）mRNA 結(jié)合位點(diǎn)：由幾種蛋白質(zhì)構(gòu)成 一個(gè)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與 mRNA 的結(jié)合。（2） P 位點(diǎn)：又叫做肽酰基 tRNA 位或給位。它是結(jié) 合起始 tRNA 并向 A 位給出氨基酸的位置。 （ 3）A 位點(diǎn)：叫做氨基酰 tRNA 位或受位。是 結(jié)合一個(gè)新

20、進(jìn)入的氨基酰 tRNA 的位置。（ 4）轉(zhuǎn)肽酶活性部位： 位于 P 位和 A 位的連接處。 （5）結(jié)合參與蛋白質(zhì)合成的起始因子（ IF）、延長(zhǎng)因子 （EF）和終止因子或釋放因子 （RF） 。 蛋白質(zhì)生物合成的基本過(guò)程： （ 含一道大題，詳見(jiàn)平時(shí)作業(yè)本 ） 蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾： （ 1）氨基端和羧基端的修飾。 氨基端乙?；患柞；?jīng)酶水解而 除去， 蛋氨酸殘基由氨肽酶催化而水解除去， 包括除去信號(hào)肽序列，因此， 成熟的蛋白質(zhì)分 子 N- 端沒(méi)有甲酰基，或沒(méi)有蛋氨酸。 （2）共價(jià)修飾。 羥基化，糖基化，磷酸化，二硫鍵的 形成 （3）亞基的聚合。 有許多蛋白質(zhì)是由二個(gè)以上亞基構(gòu)成的，這就需這些多肽

21、鏈通過(guò)非 共價(jià)鍵聚合成多聚體才能表現(xiàn)生物活性 （成人血紅蛋白由兩條鏈， 兩條鏈及四分子血紅 素所組成）。（ 4）水解斷鏈。 一般真核細(xì)胞中一個(gè)基因?qū)?yīng)一個(gè) mRNA ，一個(gè) mRNA 對(duì)應(yīng) 一條多肽鏈， 但也有少數(shù)的情況， 即一種翻譯后的多肽鏈經(jīng)水解后產(chǎn)生幾種不同的蛋白質(zhì)或 多肽（哺乳動(dòng)物的鴉片樣促黑皮激素） 。第八講 基因表達(dá)指儲(chǔ)存遺傳信息的基因經(jīng)過(guò)一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過(guò)程。 簡(jiǎn)述大腸桿菌乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、各部分的功能及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理（ 此處含有一道大題， 詳見(jiàn)平時(shí)作業(yè)本 ） 基因表達(dá)組成性表達(dá)： 指不大受環(huán)境變動(dòng)而變化的一類基因表達(dá)。 其中某些基因表達(dá)產(chǎn)物是 細(xì)胞或生物體整個(gè)

22、生命過(guò)程中都持續(xù)需要而必不可少的， 這類基因可稱為看家基因， 這些基 因中不少是在生物個(gè)體其它組織細(xì)胞、 甚至在同一物種的細(xì)胞中都是持續(xù)表達(dá)的， 可以看成 是細(xì)胞基本的基因表達(dá)。 組成性基因表達(dá)也不是一成不變的， 其表達(dá)強(qiáng)弱也是受一定機(jī)制調(diào) 控的。基因表達(dá)適應(yīng)性表達(dá)： 指環(huán)境的變化容易使其表達(dá)水平變動(dòng)的一類基因表達(dá)。 應(yīng)環(huán)境條件變 化基因表達(dá)水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)， 這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因； 相反， 隨環(huán)境條件變 化而基因表達(dá)水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因。BAC ： 細(xì)菌人工染色體載體 （ 名詞解釋 ）YAC ：是酵母人工染色體，是目前能容納最大外源 DNA 片段的

23、載體 （名詞解釋 ） MAC ： 乳類人工染色體載體 （名詞解釋 ）結(jié)構(gòu)基因群： 操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因可稱為結(jié)構(gòu)基因（SG ），各結(jié)構(gòu)基因頭尾銜接、串連排列，組成結(jié)構(gòu)基因群。啟動(dòng)子： 指能被 RNA 聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列。（ 填空題 ） 操縱子： 指能被調(diào)控蛋白特異性結(jié)合的一段 DNA 序列。終止子： 指給予 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的 DNA 序列。增強(qiáng)子： 一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件。 調(diào)控基因： 它是指編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。與操縱子結(jié)合后能減弱或阻止其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的 調(diào)控蛋白 稱為 阻遏蛋白 ，其介導(dǎo)的調(diào)控 方式稱為 負(fù)

24、性調(diào)控 。與操縱子結(jié)合后能增強(qiáng)或起動(dòng)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白稱為 激活蛋白 ， 所介導(dǎo)的調(diào)控方式稱為 正性調(diào)控 。調(diào)控基因可以在結(jié)構(gòu)基因群附近、 也可以遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因， 它是通過(guò)其基因產(chǎn)物調(diào)控 蛋白來(lái)發(fā)揮作用的，因而調(diào)控基因不僅能對(duì)同一條 DNA 鏈上的結(jié)構(gòu)基因起表達(dá)調(diào)控作用， 而且能對(duì)不在一條 DNA 鏈上的結(jié)構(gòu)基因起作用，在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)上稱為 反式作用 ，調(diào)控基因 就屬于 反式作用元件 ，其編碼產(chǎn)生的調(diào)控蛋白稱為 反式調(diào)控因子。啟動(dòng)子、 操縱子位于緊鄰結(jié)構(gòu)基因群的上游， 終止子在結(jié)構(gòu)基因群之后， 它們都在結(jié)構(gòu) 基因的附近，只能對(duì)同一條 DNA 鏈上的基因表達(dá)起調(diào)控作用，這種作用在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)上稱

25、為順式作用 ，啟動(dòng)子、操縱子和終止子就屬于 順式作用元件。操縱元的基本組成： 1）結(jié)構(gòu)基因群； 2 ）啟動(dòng)子； 3）操縱子； 4 ）調(diào)控基因； 5）終止子 基因表達(dá)的組織特異性；階段特異性。 一個(gè)受精卵含有發(fā)育成一個(gè)成熟個(gè)體的全部遺傳信 息，在個(gè)體發(fā)育分化的各個(gè)階段， 顯示出 基因表達(dá)調(diào)控在空間和時(shí)間上極高的有序性 ，從而 逐步生成形態(tài)與功能各不相同、極為協(xié)調(diào)、巧妙有序的組織臟器。第九講基因工程工具酶的概念：在 DNA 分子水平的操作中，依賴于一些重要的酶，如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶等，作為工具對(duì) DNA 進(jìn)行切割和拼接，這些酶統(tǒng)稱為基因工程工具酶。 工具酶分類： 1 ）核酸水解酶類（核酸內(nèi)切

26、酶、核酸外切酶） ；2 ）核酸合成酶類（ DNA 聚合 酶、 RNA 聚合酶、 DNA 連接酶）；3）核酸修飾酶類（甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸轉(zhuǎn)移 酶、磷酸酶）限制性內(nèi)切酶 定義： 指能識(shí)別雙鏈 DNA 分子內(nèi)部特異位點(diǎn)并在識(shí)別位點(diǎn)或附近水解磷酸 二酯鍵的一類內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱為限制酶。分類：即I型、 II型、 III 型酶三類。特性： 分子質(zhì)量為 60kd ，單鏈多肽，最適 pH 為 6 8。 NaCl 有抑制作用，能被 Mg2+ 激活，巰基有保護(hù)作用。對(duì)熱不穩(wěn)定，通常貯存于20 環(huán)境。為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有 50 甘油，使用時(shí)添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。1）

27、每一種酶都有各自特異識(shí)別位點(diǎn)；2）大多數(shù)限制酶是錯(cuò)位切割雙鏈 DNA ，產(chǎn)生 5 '或 3 '粘性末端； 3 ）部分限制酶沿識(shí)別序列內(nèi)的對(duì)稱軸上切割DNA 雙鏈，產(chǎn)生平末端根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶來(lái)源和菌株進(jìn)行命名：1 、用來(lái)源細(xì)菌的英文縮寫(xiě)斜體符號(hào)命名 2 、它的第一個(gè)字母大寫(xiě)，來(lái)源細(xì)菌屬名的第1 個(gè)字母 3 、第二、三字母小寫(xiě)，來(lái)源細(xì)菌種名的頭 2 個(gè)字母 4 、第四個(gè)字母代表菌株5 、最后用羅馬字母表示同一菌株中不同限制酶的編號(hào)。回文結(jié)構(gòu)： 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列具有180°旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)。5' -GAATTC-3 '3'-CTTAAG

28、-5影響因素： 溫度：一般 37 鹽離子濃度： Na， Mg2 緩沖體系：具有穩(wěn)定 pH 環(huán)境的 Tris-HCl 緩沖體系， DTT 用于保持酶穩(wěn)定性和活性 反應(yīng)體積和甘油 濃度：商品化的限制性內(nèi)切核酸酶均加 50 甘油作為保護(hù)劑，一般在 -20 保存。 反 應(yīng)時(shí)間：通常為 1h ；進(jìn)行大量 DNA 酶切反應(yīng)時(shí)一般讓酶解過(guò)夜 DNA 純度和結(jié)構(gòu)： 一個(gè)酶單位定義： 1h 內(nèi)完全酶解 1 g噬菌體 DNA 所需的酶量 同尾酶： 某些限制酶來(lái)源不同、識(shí)別序列不同，但可產(chǎn)生相同的粘性末端。（ 名詞解釋 ）同位酶： 識(shí)別相同的序列但切割位點(diǎn)不一樣的限制性核酸內(nèi)切酶。 （ 名詞解釋 ） 同功異源酶（同

29、裂酶） ： 來(lái)源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的限制酶。 （ 名詞解釋 ） 酶的活性單位 1 個(gè)活性單位：在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下 （包括溫度、 pH 和離子強(qiáng)度等 ）,1h 內(nèi)在50 l容積中完全酶解 1g特定DNA 底物（通常用入 DNA）所需要的酶量。 （名詞解釋） DNA 連接酶作用機(jī)理： 連接酶的作用：在雙鏈 DNA 中， DNA 連接酶能催化具有鄰近 3' 羥基和 5'磷酸基的單鏈形成磷酸二酯鍵， 促使具有互補(bǔ)粘性末端或平末端的載體和供 體 DNA 片段連接，使之成為一個(gè)完整的重組 DNA 分子。 連接的部位：磷酸二酯鍵， 不是氫鍵。 結(jié)果：黏性末端（包括平末端）連接起來(lái)。作

30、用過(guò)程 1）連接酶與輔助因子 ATP 或 NAD 形成酶 -AMP 復(fù)合物； 2 ）AMP 作用于 DNA 缺口的 5'-末端磷酸基團(tuán)； 3）缺口 3' -OH 對(duì)活躍的磷原子作親核攻擊，形成新的磷酸 二酯鍵，封閉切口Taq DNA 聚合酶： 從棲熱水生菌中分離純化的依賴 DNA 的 DNA 聚合酶，最適溫度 75 -80 ；最適 pH7.8（Tris-HCl） ；需要 Mg2+（10 mmol L），在低濃度 Mn2+（2 mmol/L） 中有低 活性， Ca2+使其完全失活，一價(jià)陽(yáng)離子高至 0.1 moIL 對(duì)活性無(wú)影響，而最適濃度 NaCl 為 40 mmol/L ， K

31、Cl 為 60 mmol/L 。第十講概念： 攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、 擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱載體。即用于克隆、 運(yùn)載 和轉(zhuǎn)移目的基因并能自我復(fù)制的 DNA 分子。必備條件： 具復(fù)制原點(diǎn)： 在宿主細(xì)胞中不僅能獨(dú)立地自我復(fù)制， 而且能與攜帶的外源 DNA 一起復(fù)制 能與目的基因連接 - 具多個(gè)限制酶切點(diǎn)便于篩選鑒定 - 具有標(biāo)記基因，而宿主細(xì)胞并不具有 操作簡(jiǎn)單分子量小、高拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化效率高、容易從宿 主細(xì)胞中分離純化克隆載體： 可以克隆和運(yùn)載目的基因并轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。 細(xì)菌質(zhì)粒載體 、 噬菌體載體 、 柯斯質(zhì)粒載體 。概念： 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、

32、能自我復(fù)制、 易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子 10kb 。 分類： F 質(zhì)粒（ F 因子或性質(zhì)粒）R 質(zhì)粒（抗藥性因子）Col 質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）pBR322 是以 4 個(gè)不同質(zhì)粒 DNA 為基礎(chǔ)通過(guò) DNA 重組技術(shù)發(fā)展構(gòu)建而成的克隆載體。 pBR322 載體的特點(diǎn)：分子量小（ 4.3kb ）、拷貝數(shù)高、含四環(huán)素和氨芐青霉素兩種抗生素抗 性基因作為選擇標(biāo)記、對(duì)多種常見(jiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶僅有一個(gè)切割位點(diǎn)。pUC 載體 系統(tǒng)以 pBR322 為基礎(chǔ)，去除了包括四環(huán)素抗性基因在內(nèi)40的 DNA ，換用了M13 噬菌體的 476bp 片段，內(nèi)含 LacZ 基因的 5' -序列以表達(dá)

33、半乳糖苷酶的片段， LacZ 的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子 Plac 和操縱基因 O命名規(guī)則： pUC19“ p ”表示質(zhì)粒（ plasmid ）“UC ”表示發(fā)現(xiàn)或構(gòu)建該質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱 “19”表示該質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)編號(hào)藍(lán)白斑： 如果在多克隆位點(diǎn)中插入外源 DNA ，打斷了 -半乳糖苷酶的部分基因，不再產(chǎn)生 - 肽鏈，就不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段結(jié)合生成有活性的-半乳糖苷酶，結(jié)果 X-gal保持無(wú)色，插入外源 DNA 菌落呈白色。 檢測(cè)結(jié)果 ：重組子菌落是白（無(wú)）色的，而空載體 轉(zhuǎn)化的菌落是藍(lán)色的。噬菌體即細(xì)菌病毒一類的總稱。 25kb柯斯質(zhì)粒載體 又叫粘粒載體， 這是一種由人工構(gòu)建的

34、含有噬菌體 DNA 的 cos 位點(diǎn)和質(zhì)粒 復(fù)制子的特殊類型的雜和質(zhì)粒載體 ,具有質(zhì)粒和噬菌體的雙重特征，被稱為cosmid ，指帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒 40kb 。 構(gòu)建基因文庫(kù) 表達(dá)載體： 克隆、運(yùn)載和轉(zhuǎn)移目的基因到受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增,使之表達(dá)。表達(dá)載體的特點(diǎn)： 具有克隆載體所具有的基本特性； 具有可被宿主細(xì)胞識(shí)別的基因表達(dá)調(diào)控 元件：?jiǎn)?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS ）（RBS 由 SD 序列、核糖體小亞基識(shí)別序列和起始 密碼（ ATG ）組成，但有時(shí)也將 SD 序列稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)。 SD ：Shine-Dalgarno ，人 名）、終止子（依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止；不依賴因子的轉(zhuǎn)錄

35、終止）第十一、第十二講PCR （聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）定義： 在試管中，利用 DNA 聚合酶、一對(duì)引物和四種 dNTP ，對(duì) 模板 DNA 反復(fù)多次地進(jìn)行復(fù)制，從而得到大量擴(kuò)增特定產(chǎn)物的反應(yīng)過(guò)程。PCR 體系： 待擴(kuò)增的 DNA （模板），一對(duì)寡聚核苷酸引物，耐高溫的 Taq DNA 聚合酶， 4 種脫氧核苷酸的混合物（ dNTP ）， Mg 2+ /Thris-HClPCR 反應(yīng)程序： 變性 94 退火 55 延伸 72預(yù)變性 4min變性退火 3060 秒延伸再延伸 7min反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RT-PCR ）: 反轉(zhuǎn)錄 PCR即以mRNA 作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA （單 鏈 DNA ）

36、的 PCR 方法 . 。 一般分兩步進(jìn)行：第一步用反轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ， 第二步以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。目前已發(fā)現(xiàn)一種 rTth 酶 ，既有反轉(zhuǎn)錄酶活性又有 DNA 聚合酶活性。因此做 RT-PCR 可簡(jiǎn) 單到用一種酶和一種緩沖體系在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)直接擴(kuò)增 RNA 。生物芯片： 是將細(xì)胞、蛋白質(zhì)、 DNA 及其他生物組分，通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)集中 點(diǎn)在一個(gè)平方厘米大小的固體芯片表面， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)它們的準(zhǔn)確、快速、 高效、 敏感的大信息 量的檢測(cè)、分析和處理。 特點(diǎn)： 高通量、微型化、自動(dòng)化 生物芯片主要分為 基因芯片 和 蛋白芯片DNA 測(cè)序技術(shù)： ddN

37、TP ，雙脫氧核苷酸終止法： 原理：利用 DNA 聚合酶合成 DNA ，在 DNA 的聚合過(guò)程中在特異性的核苷酸位置終止反應(yīng)而進(jìn)行測(cè)序。反應(yīng)的終止依賴于底物 2' ,3' -雙脫氧核苷三磷酸（ ddNTP ）。在 DNA 聚合酶作用下 能通過(guò)其 5 '三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的 DNA 鏈中，形成磷酸二酯鍵，但由于缺乏3 '羥基而不能同后續(xù)的 dNTP 或 ddNTP 形成磷酸二酯鍵， 因此， 一旦 ddNTP 摻入 DNA 的新 生鏈中，聚合反應(yīng)就會(huì)終止?；瘜W(xué)修飾法： 用 4 組化學(xué)試劑裂解末端標(biāo)記的 DNA 分子，其中每一組化學(xué)試劑特異地針對(duì) 一種或一類堿基進(jìn)行切割，由此產(chǎn)生的 4 組裂解產(chǎn)物均為不同長(zhǎng)度的 DNA 片段的混合物。 每一組反應(yīng)產(chǎn)物中都有一套帶相同標(biāo)記末端的長(zhǎng)短不一的 DNA 片段原理： 1 ）放射性同位素標(biāo)記待測(cè) DNA3 末端或 5末端 ;2 ）用特殊的化學(xué)試劑處理來(lái)裂解具末端放射標(biāo)記的DNA 分子 ,造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)