骨微結(jié)構(gòu)與微損傷檢測方法的研究與進展

1、www.CRTER.org許燦，等. 骨微結(jié)構(gòu)與微損傷檢測方法的研究與進展骨微結(jié)構(gòu)與微損傷檢測方法的研究與進展許 燦，李明清，王成功，李康華，劉 華(中南大學湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長沙市 410008)引用本文：許燦，李明清，王成功，李康華，劉華. 骨微結(jié)構(gòu)與微損傷檢測方法的研究與進展J.中國組織工程研究，2016，20(44):6673-6681.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.44.020 ORCID: 0000-0003-3878-3963(許燦)文章快速閱讀：骨微結(jié)構(gòu)與微損傷的檢測方法骨微結(jié)構(gòu)、微損傷常用檢測方法骨微結(jié)構(gòu)、微損傷基本概念許燦，男，19

2、85年生，湖南省岳陽市人，漢族，博士，主治醫(yī)師，主要從事足踝畸形與創(chuàng)傷研究。通訊作者：劉華，博士，副主任醫(yī)師，中南大學湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長沙市 410008中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)44-06673-09稿件接受：2016-08-10micro-CT；增強micro-CT；同步輻射光源顯微CT：SR-CT掃描電子顯微鏡：SEM骨組織形態(tài)計量學：BHMT；堿性品紅骨大塊染色；序貫熒光染色；保留四環(huán)素標記的熒光染色；連續(xù)銑削成像(3D)；激光掃描共聚焦顯微鏡：LSCM(3D)有創(chuàng)方法無創(chuàng)方法文題釋義：骨微損傷：是指骨因“疲勞”而導致的骨顯微結(jié)構(gòu)的改

3、變。材料學上的“疲勞”現(xiàn)象是指材料在低于斷裂強度的較小應力/應變周期性作用下，材料中會萌生微觀裂紋并逐漸擴展，當損傷積累到一定程度時就會最終導致材料的整體失效。骨組織在日常的生理負荷周期性作用下會萌生兩種常見的骨微損傷：“線性”和“彌散性”微損傷。骨微損傷檢測方法：目前檢測骨微損傷最常用的方法是堿性品紅骨大塊染色法，該方法能夠快速有效的檢測和評估線性和彌散性微損傷。隨著各種高分辨檢測設備的進步，micro-CT和激光共聚焦顯微鏡能在微米層級對骨微結(jié)構(gòu)以及微損傷的三維形態(tài)進行分析，而掃描電鏡則能夠在納米層級檢測微損傷的細節(jié)，但無法觀察微損傷的整體形貌。摘要背景：骨質(zhì)疏松所致的骨脆性增加和骨質(zhì)量下

4、降越來越受到人們的重視。骨微結(jié)構(gòu)和微損傷是影響骨質(zhì)量的重要因素，其檢測技術和設備的發(fā)展經(jīng)歷了比較長的歷史進程。目的：簡述骨微結(jié)構(gòu)和骨微損傷的基本概念，歸納總結(jié)骨微結(jié)構(gòu)和微損傷檢測技術的研究進展。方法：檢索Pubmed數(shù)據(jù)庫和中國知識資源總庫(CNKI)系列數(shù)據(jù)庫1990年1月至2016年6月收錄的骨微結(jié)構(gòu)和微損傷相關綜述和論文報告，檢索詞為骨微損傷(bone microdamage)、骨微結(jié)構(gòu)(bone microarchitecture)和檢測(detect/detective/detecting)，最終納入65篇文獻進行分析。結(jié)果與結(jié)論：堿性品紅骨大塊染色能夠快速有效的檢測和評估線性和彌散

5、性微損傷，micro-CT和激光共聚焦顯微鏡能在微米層級對骨微結(jié)構(gòu)以及微損傷的三維形態(tài)進行分析，而掃描電鏡則能夠在納米層級觀察骨微損傷的形貌細節(jié)，但無法整體觀察微損傷；應當根據(jù)實驗需要靈活使用各種方法，以獲得骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的各種相關信息，最終有助于在不同層級上理解骨微結(jié)構(gòu)和微損傷對骨質(zhì)量的影響。關鍵詞：骨科植入物；骨植入物；骨微結(jié)構(gòu)；骨微損傷；檢測方法；國家自然科學基金主題詞：骨質(zhì)疏松；骨折；骨密度；組織工程基金資助：國家自然科學基金(81301543)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Research progress of bone mic

6、roarchitecture and microdamage detectionXu Can, Li Ming-qing, Wang Cheng-gong, Li Kang-hua, Liu Hua (Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone fragility and poor bone quality due to osteoporosis are a majo

7、r and increasing concern. Bone microarchitecture and microdamage, the important factors of bone quality, their detection technology and instrument have experienced a long development process.OBJECTIVE: To give a brief introduction of the concept of the bone microarchitecture and microdamage, then to

8、 summarize the research progress of their detective methods.METHODS: PubMed and CNKI databases were retrieved for reviews and articles related to bone microarchitecture and microdamage published from January 1990 to June 2016 using the keywords of “bone microarchitecture, bone microdamage and detect

9、/detective/detecting” in Chinese and English, respectively. Finally a total of 65 articles were selected for overview.RESULTS AND CONCLUISON: (1) Bulk staining is a quick and useful way to confirm and assess linear microcracks and diffuse damage. Micro-CT and confocal microscopy allow visualization

10、at the micron scale, and are useful tools to understand the three-dimentional nature of bone microdamage. Scanning electron microscope lacks the ability to investigate large regions of microdamage, but allows users to probe in extensive details at the nano scale. (2) Ultimately, we recommend the use

11、 of multiple imaging modalities according to the experimental needs to obtain useful information about bone quality and microdamage formation, across the scales of hierarchy in bone.Subject headings: Osteoporosis; Fractures, Bone; Bone Density; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science

12、 Foundation of China, No. 81301543Cite this article: Xu C, Li MQ, Wang CG, Li KH, Liu H. Research progress of bone microarchitecture and microdamage detection. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(44): 6673-6681.3ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction Xu Can, M.D., Attending

13、physician, Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, ChinaCorresponding author:Liu Hua, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China骨質(zhì)疏松

14、癥是一種因“骨強度”降低而導致骨折易發(fā)的骨代謝性疾病。骨強度即骨骼用以抵御骨折的能力，但目前尚無精確的方法測量骨強度，因而臨床上常使用骨密度來替代骨強度，并作為骨折風險的預測工具?？上У氖?，骨密度雖然是反映骨強度和骨折風險的重要因素，但它并不能完全預測骨折風險。因為當骨密度相同時，骨折的風險性卻隨著年齡增加而增加，這一現(xiàn)象提示人們，獨立于骨密度之外，還有某些因素可以影響骨折的風險性，這就是所謂“骨質(zhì)量”1?，F(xiàn)有證據(jù)表明骨質(zhì)量是影響骨折風險的關鍵因素之一。隨著社會人口的老齡化，骨質(zhì)疏松所致的骨脆性增加和骨質(zhì)量下降越來越受到人們的重視2。骨質(zhì)量涉及了骨組織的各種構(gòu)成因素，包含骨基質(zhì)的礦化程度、骨膠

15、原的結(jié)構(gòu)與組成、骨微結(jié)構(gòu)、骨重建的更新率以及骨微損傷的數(shù)量和形態(tài)等方面3。其中，骨微結(jié)構(gòu)和微損傷對于人們深入理解骨折風險十分關鍵4。骨微結(jié)構(gòu)、微損傷的檢測技術和設備的發(fā)展經(jīng)歷了比較長的歷史進程。文章首先簡述了骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的一些基本概念，進而綜述了當前常用于骨微結(jié)構(gòu)和微損傷檢測的技術和設備，包括早期的骨大塊染色法和后來出現(xiàn)的一些能夠檢測骨超微結(jié)構(gòu)的高分辨率影像設備。這些設備和技術對于深入理解骨微結(jié)構(gòu)和微損傷都很有幫助。1 資料和方法 Data and methods1.1 資料來源 由第一作者檢索1990年1月至2016年6月Pubmed數(shù)據(jù)庫與CNKI數(shù)據(jù)庫。英文檢索詞為“bone，mic

16、rodamage”，中文檢索詞為“骨微損傷，檢測”。檢索到英文文獻483篇，中文文獻53篇，文獻總計536篇。1.2 納入與排除標準納入標準：文章內(nèi)容與骨微結(jié)構(gòu)及微損傷密切相關；對于使用相同檢測技術的研究，選擇近期發(fā)表文獻以及在權威雜志上發(fā)表的早期文獻；在納入文獻閱讀的過程中發(fā)現(xiàn)的，早于1990年但對相關技術發(fā)展有重要意義的文獻。排除標準：對于相關檢測技術的發(fā)展沒有特殊意義的文獻；重復文獻；非中、英文文獻。1.3 數(shù)據(jù)提取 共檢索文獻量536篇，其中中文文獻53篇，英文文獻483篇，此外補充檢索英文文獻9篇(早于1990年)。排除與研究目的相關性差及內(nèi)容重復的文獻480篇，共納入65篇符合標準

17、的文獻進行綜述。2 結(jié)果 Results 2.1 骨組織微結(jié)構(gòu)2.1.1 皮質(zhì)骨(compact bone) 皮質(zhì)骨由不同排列方式的骨板組成。骨板排列方式有外環(huán)骨板、內(nèi)環(huán)骨板、骨單位骨板和間骨板幾種類型(圖1)。6681ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH外環(huán)骨板血管哈弗氏骨板骨膜穿通纖維血管Volkmann管哈弗氏管圖1 皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)哈弗氏管間骨板黏合線Volkmann管哈弗氏骨板外環(huán)骨板內(nèi)環(huán)骨板圖2 內(nèi)、外環(huán)骨板與骨單位骨板間骨板黏合線縱纖維骨板哈弗氏管骨陷窩環(huán)纖維骨板骨小管圖3 骨單位圖4 松質(zhì)骨外環(huán)骨板(outer circumferent

18、ial lamella)：環(huán)繞骨干表面且呈平行排列，約十數(shù)層或數(shù)十層，比較整齊。外環(huán)骨板的外面與骨膜緊密相接，其中可見橫向穿行的管道，稱穿通管，又稱?？寺?Volkmann)管，外膜的小血管由此進入骨內(nèi)(圖2)。 內(nèi)環(huán)骨板(inner circumferential lamella)：居于骨干的骨髓腔面，僅由數(shù)層骨板組成，不如外環(huán)骨板平整。內(nèi)環(huán)骨板中也有穿通管穿行，管中的小血管與骨髓血管相通連。 骨單位骨板(osteon lamella)：又稱哈弗氏骨板(Haversian lamella)，位于內(nèi)、外環(huán)骨板之間，是骨干皮質(zhì)骨的主要組成部分。骨單位骨板呈同心圓排列，中央的管道為中央管(cent

19、ral canal)，又稱哈弗氏管。骨單位(osteon)又稱哈弗氏系統(tǒng)(Haversian system)，是皮質(zhì)骨中主要起支持作用的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)單位，呈長筒形，長0.6-2.5 mm，直徑30-70 m，其長軸與骨干長軸平行，由4-20層同心圓排列的骨板圍成。骨單位表面有一層黏合質(zhì)，它是一層含鹽多、含纖維少的骨基質(zhì)，在橫斷面的骨磨片上呈折光較強的輪廓線，稱為黏合線(cement line)，構(gòu)成骨單位的邊界(圖3)。骨單位內(nèi)部各層骨板間的骨陷窩(bone lacuna)和骨小管(bone canaliculus)相互通連，最內(nèi)層骨小管則開口于中央管，管內(nèi)有骨膜結(jié)締組織及血管和神經(jīng)，骨細胞從中

20、央管內(nèi)的組織液獲得營養(yǎng)并排出廢物。但骨單位最外層的骨小管在黏合線以內(nèi)折返，不與相鄰的骨單位內(nèi)的骨小管相通。相鄰骨單位的中央管相互間以橫行的穿通管相通連。 間骨板：為填充在骨單位之間的一些半月形或不規(guī)則的平行骨板，它是在骨生長改建中原有的骨單位或外環(huán)骨板未被吸收的殘留部分。間骨板內(nèi)存在骨小管但無血管通道，有時骨單位外層的骨小管會穿過黏合線，與間骨板內(nèi)的骨小管相聯(lián)通，形成一條骨單位中央管和間骨板之間的物質(zhì)交換通道。2.1.2 松質(zhì)骨(cancellous bone) 松質(zhì)骨分布在長骨的干骺端，是由棒狀或者平板狀骨小梁相互聯(lián)通的三維立體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，狀如“腳手架”，承受復合力學負荷，對于皮質(zhì)骨的支撐作用

21、極為重要。松質(zhì)骨內(nèi)部具有大小各異的互聯(lián)孔，由此形成孔隙率和密度不同的結(jié)構(gòu)。棒狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)形成了低密度的松質(zhì)骨，細胞處于較開放的環(huán)境，而板狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)則構(gòu)成了高密度的松質(zhì)骨，細胞處于較閉合的環(huán)境(圖4)。松質(zhì)骨的相對密度是指松質(zhì)骨標本密度與完全致密的皮質(zhì)骨標本密度的比值，其范圍為0.05-0.7，閾值對應的孔隙率為90%-30%。松質(zhì)骨的骨小梁由成層排列的骨板和骨細胞(osteocyte)構(gòu)成。骨小梁上的骨小管開口于骨髓腔，骨細胞從中獲得營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物。骨小梁具有廣泛的表面積，是骨代謝最活躍的部位，也是骨丟失出現(xiàn)最早的區(qū)域，在其表面可見較多的細胞成分，包括成骨細胞(osteoblast)、破骨細

22、胞(osteoclast)和襯細胞等(圖5)。各種細胞不同的比例變化，反應其功能狀態(tài)。骨陷窩骨細胞破骨細胞成骨細胞骨小管骨板松質(zhì)骨皮質(zhì)骨骨小梁骨小管在骨小梁表面的開孔內(nèi)膜骨板圖5 松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)2.2 骨微損傷定義 早在1960年，F(xiàn)rost就利用不脫鈣骨組織染色切片的方法發(fā)現(xiàn)了骨的顯微損傷，然而Frost所觀察到的損傷，究竟是真正的微損傷還是實驗過程人為操作的破壞，一直存在爭論并持續(xù)多年。直到20世紀90年代初，眾多學者利用Burr等的堿性品紅骨大塊染色技術才最終證實了微損傷的存在。骨微損傷是指骨因“疲勞”而導致的骨顯微結(jié)構(gòu)的改變。材料學上的“疲勞”現(xiàn)象是指材料在低于斷裂強度的較小應力/應變周

23、期性作用下，材料中會萌生微觀裂紋并逐漸擴展，當損傷積累到一定程度時就會最終導致材料的整體失效。骨組織在日常的生理負荷周期性作用下會萌生兩種常見的骨微損傷：“線性”和“彌散性”微損傷。當前人們對于線性微損傷的認識較為清晰，但對彌散性微損傷的認識還有所欠缺。線性微損傷和彌散性微損傷具有同等的重要性，二者在形態(tài)上有一定的相似性，但在力學和生物學特征上有著顯著的差異。線性微損傷在骨組織切片上表現(xiàn)為長度50- 100 m的邊界銳利的裂紋，它們是在步行和跑步等生理負荷的周期性作用下形成的。對健康人而言，生理負荷周期性作用下萌生的微損傷會隨著骨重建被修復而不產(chǎn)生臨床問題，但是當微損傷積累的速度超過了骨重建的

24、修復能力后，微裂紋會在應力的反復作用下逐漸擴展并最終導致骨折。線性微裂紋多發(fā)生于間質(zhì)骨。間質(zhì)骨是在骨重建中原有骨單位或外環(huán)骨板未被吸收的殘留部分，間質(zhì)骨較骨單位內(nèi)的骨組織年齡較老因而經(jīng)歷了更多疲勞載荷的周期作用。有研究顯示，間質(zhì)骨中非酶膠原交聯(lián)程度和礦化程度要高于新生骨單位的骨基質(zhì)，這可能是線性微損傷好發(fā)于間質(zhì)骨的內(nèi)源性因素。骨微結(jié)構(gòu)的研究顯示，當沿著骨長軸觀察時，微裂紋的長度顯著長于橫斷面所觀察到的長度。這是因為裂紋通常都沿著結(jié)構(gòu)中的潛在間隙延伸。許多研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨中的線性微損傷會隨著年齡增長而顯著增加；Courtney等5發(fā)現(xiàn)老齡骨和年輕骨接受相同的疲勞載荷周期作用直至屈服后，老齡

25、骨中的線性微損傷要多于年輕骨。這些研究都說明線性微損傷與骨質(zhì)量以及骨折風險相關，但是他們之間的確切關系至今仍未明確，其主要原因是現(xiàn)有的微損傷檢測方法無法直接對臨床患者進行觀察。彌散性微損傷在骨組織切片上表現(xiàn)為彌散性的片狀紅染區(qū)域，長度一般小于10 m。人們首先在堿性品紅骨大塊染色的皮質(zhì)骨標本中發(fā)現(xiàn)了彌散性微損傷，高分辨率下觀察可以發(fā)現(xiàn)它們是由多群極小的骨細胞裂紋(1 m以下)聚集構(gòu)成的6-9，后來人們又在松質(zhì)骨中發(fā)現(xiàn)了彌散性微損傷7。在所有微損傷中，彌散性微損傷是最早且最易于萌生的。在生理負荷周期性作用的早期就會迅速出現(xiàn)彌散性微損傷，此外，當大小恒定的載荷持續(xù)作用于骨標本一段時間后，也會出現(xiàn)彌

26、散性微損傷(材料學上稱為“蠕變”)。彌散性微損傷并非線性微損傷的延伸，Boyce10和Diab等11研究發(fā)現(xiàn)線性和彌散性微損傷發(fā)生在相互獨立的區(qū)域；彌散性微損傷常出現(xiàn)于張應力作用區(qū)域，而線性微損傷則常出現(xiàn)于壓應力或剪切應力作用區(qū)域10，12。同時，有研究發(fā)現(xiàn)人體對彌散性微損傷的生理反應完全不同于線性微損傷13。這些都說明二者在力學和生物學特征上有著顯著差異。2.3 骨微結(jié)構(gòu)以及骨微損傷的檢測方法2.3.1 破壞性方法骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的二維檢測從骨組織形態(tài)計量學到堿性品紅骨大塊染色法：骨微結(jié)構(gòu)的常用檢查方法骨組織形態(tài)計量學：傳統(tǒng)方法制作骨組織切片時需要將骨組織進行脫鈣、脫水透明、石蠟包埋及切片，

27、再染色觀察。然而，在脫鈣的過程中，往往原有組織的邊緣形態(tài)會發(fā)生改變，不能準確地評估骨的形態(tài)。1960年美國骨整形外科醫(yī)生Frost14提出了一種定量研究骨微結(jié)構(gòu)和骨量的技術，其采用“不脫鈣硬包埋法”和“活體熒光標記法”進行骨組織標本制作，更好地保留了骨組織微細結(jié)構(gòu)。這就是目前檢查骨微結(jié)構(gòu)與評價骨轉(zhuǎn)換重建最常用和有效的方法“骨組織形態(tài)計量學”。骨組織形態(tài)計量學的測定對象是不脫鈣且?guī)в小盎铙w”熒光標記的骨標本，其計算結(jié)果包括靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)。通過不脫鈣硬包埋法能夠較好的保持骨組織的完整性，計算所得的骨小梁體積百分數(shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(T

28、b.Sp)、皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)等靜態(tài)參數(shù)值可以定量反映骨組織的微結(jié)構(gòu)；同時，采用“活體”四環(huán)素、鈣黃綠素雙標記，可將時間因素以熒光標記在骨重建過程中，從而動態(tài)地觀察骨組織的變化，得到動態(tài)參數(shù)信息，即所謂“動態(tài)骨組織形態(tài)計量學”(dynamic bone histomorphometry)；骨微損傷的常用檢查方法堿性品紅骨大塊染色(en bloc basic fuchsin staining)：目前檢測骨微損傷最常用的方法是堿性品紅骨大塊染色法。早在1960年Frost14就已經(jīng)提出了堿性品紅骨大塊染色，但當前通用的步驟是由Burr等15于1990年在Frost的基礎上改進后提出的?，F(xiàn)行方

29、法是：將含有微損傷的骨塊用體積分數(shù)70%乙醇固定48 h，然后置入含1%堿性品紅的乙醇(體積分數(shù)80%，90%，100%)內(nèi)進行染色和逐級脫水。染色后的皮質(zhì)骨可以直接切片或者用有機玻璃包埋后切片，但對松質(zhì)骨需要做有機玻璃包埋后切片，切片厚度為50-100 m。骨大塊染色的優(yōu)點是可以區(qū)分真正的骨微損傷和標本處理過程中的人為損傷。由于標本處理(包埋和切片)是在骨染色之后，所以標本處理所產(chǎn)生的微損傷并不染色。最初，人們使用常光顯微鏡觀察堿性品紅染色結(jié)果，但要將體內(nèi)產(chǎn)生的全染色微損傷和加工過程中產(chǎn)生的部分染色以及未染色微損傷區(qū)分開來十分耗時費力。由于堿性品紅是一種兼具強烈紅光和熒光的染色劑，1998年

30、Lee等16提出在熒光顯微鏡下進行觀察骨微損傷更加簡單快速并且準確；1999年Huja等17證實了熒光顯微鏡能夠更敏感的檢測骨微損傷，在定量評定時可以產(chǎn)生更精確的效果。堿性品紅骨大塊染色法的發(fā)展序貫熒光染色標記法(sequential fluorochrome labelling)：堿性品紅雖然能夠用于微損傷染色，但存在兩個缺點。首先，由于堿性品紅染色的原理是它能夠進入骨微結(jié)構(gòu)中的空隙，所以它對微損傷染色的同時也會對骨微結(jié)構(gòu)中的骨小管和血管染色，也就是說它不具備針對骨微損傷的“位點特異性”；其次，在應力作用下骨微損傷會擴展，如果要顯示微損傷的擴展過程，就必須使用兩種顏色不同的染色劑在微損傷擴展

31、的前后分別染色；而堿性品紅作為單一染色劑自然無法顯示骨微損傷的擴展過程。為了解決這兩個問題，研究者們提出了序貫熒光染色標記法。其所選擇的染色劑為鈣離子螯合熒光染色劑(具備針對微損傷的位點特異性)，并且在加載前后使用不同熒光的螯合劑對微損傷各進行一次染色，這樣就可以區(qū)分加載前已經(jīng)存在的微損傷和加載后新發(fā)以及在原有基礎上擴展的微損傷。2000年Lee等18比較了5種鈣螯合熒光染色劑對骨微損傷的染色效果，發(fā)現(xiàn)茜素氨羧絡合劑、鈣黃綠素、鈣黃綠素藍、土霉素以及二甲酚橙對微損傷具有與堿性品紅相同的檢測能力，但缺點是不同染色劑邊界欠清晰；2002年OBrien等19對該法做了改進，他提出了幾種熒光染色劑的理

32、想濃度并聯(lián)合使用離子色譜法(ion chromatography)以提高顯像效果；2003年OBrien等20應用序貫染色成功檢測了疲勞試驗導致的皮質(zhì)骨微損傷的萌生、擴展過程。兼顧微結(jié)構(gòu)與微損傷檢測的方法保留四環(huán)素標記的熒光染色/雙染色法(double labeling method)：2011年Burt-Pichat等21在骨組織形態(tài)計量學方法和大塊骨序貫染色的基礎上提出了保留四環(huán)素標記的熒光染色。研究首先使用四環(huán)素(動態(tài)骨組織形態(tài)計量學常用的標記物)進行骨組織的“活體”熒光標記，取出骨標本后再使用各種不同的螯合熒光染色劑標記加工過程中產(chǎn)生的微損傷并比較染色效果，最終發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素和二甲酚橙能

33、夠較好的顯示新發(fā)微損傷同時保留活體四環(huán)素熒光標記。這就使得研究者們可以在獲取骨組織形態(tài)計量學參數(shù)的同時檢測骨微損傷。骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的三維成像：連續(xù)銑削成像法(serial block face imaging)：雖然有許多方法可以在無創(chuàng)的條件下對骨微結(jié)構(gòu)進行三維成像，但這些方法在提高成像分辨率的同時往往需要減小標本體積。為了保證較高的分辨率同時兼顧標本尺寸，1997年Beck等22在骨大塊染色法的基礎上提出了連續(xù)銑削成像法(serial block face imaging)。具體方法是：對骨標本進行染色和包埋后，使用CNC數(shù)控銑床連續(xù)銑削骨標本，每次僅削除5-20 m的薄層。進而使用高分辨

34、率數(shù)碼相機拍攝斷面圖像，如斷面較大，則使用計算機精確控制攝像頭移動后逐格拍照，后期再進行圖像拼接而構(gòu)成高分辨單層斷面圖像。接著，銑床再次削除薄層骨組織并拍攝斷面，這樣逐層步進，最終獲取標本的連續(xù)斷層圖像，并使用相關軟件對標本連續(xù)斷層圖像進行三維重建。2007年Kazakia等23在該技術的基礎上引入了全自動銑削并使用二甲酚橙對微損傷進行熒光染色，由此極大的減小了工作強度并使連續(xù)銑削法能夠檢測骨微損傷，試驗中標本直徑8 mm，分辨率達到了3 m×3 m×8 m；2008年Bigley等24比較了基于熒光染色的連續(xù)銑削成像法和序貫熒光染色標記法，證實二者在檢測骨微損傷時具有相同

35、的可信度；2009年Slyfield等25以及Tkachenko等26在一項針對骨小梁上破骨細胞形成的吸收陷窩的研究中，將基于熒光染色連續(xù)銑削法的分辨率進一步提高到0.7 m；由于熒光染色連續(xù)銑削法已經(jīng)能夠在三維空間顯示能夠反映骨轉(zhuǎn)換重建的吸收陷窩，2012年Slyfield等27正式提出了三維動態(tài)骨組織形態(tài)劑量學(Three-dimensional dynamic bone histomorphometry)的概念，之前只能通過經(jīng)典的雙染色二維切片獲得的骨轉(zhuǎn)換重建動態(tài)參數(shù)就此內(nèi)能夠通過熒光染色連續(xù)銑削法在三維空間內(nèi)獲??；2015年Goff等28使用鈣黃綠素和二甲酚橙染色標記骨微損傷，繼而使用

36、連續(xù)銑削法構(gòu)建三維模型(標本直徑5.4 mm，高度4 mm)，試驗中分辨率進一步提高到了0.7 m×0.7 m×5 m，實驗清晰顯示了骨微損傷的三維空間分布，充分體現(xiàn)了熒光染色連續(xù)銑削法對骨微損傷的檢測能力。激光掃描共聚焦顯微鏡：是一種利用計算機、激光和圖像處理技術獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)的分析儀器。激光點光源照射標本(標本預先做熒光染色)后，會在焦平面上形成一個輪廓分明的小光點，而該點被照射后所發(fā)出的熒光會被物鏡收集而成像，這樣以激光逐點掃描樣品后，會最終聚合形成整個焦平面的共聚焦清晰圖像。由于可進行熒光染色且具備較高三維空間分辨率，激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應用于各個學科。

37、1994年Zioupos等29首先使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測了骨微損傷；2000年OBrien等30比較了激光掃描共聚焦顯微鏡和連續(xù)銑削成像法對堿性品紅染色的骨標本中微損傷的檢測能力，認為二者都可以有效的檢測骨微損傷；2001年Zioupos31使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測了皮質(zhì)骨中的微損傷，分辨率達到10 m；2007年Diab等32使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測了堿性品紅染色的皮質(zhì)骨在疲勞試驗中的微損傷形態(tài)；2012年Poundarik等33使用激光掃描共聚焦顯微鏡在更高分辨率下對彌散型微損傷中的亞微米級裂紋和膨脹帶(dilatational bands)進行了檢測。激光掃描共聚焦顯微鏡的

38、優(yōu)點是可以對微損傷以及微裂紋進行三維重建，具有較高的空間分辨率。其缺點是視野有限，景深較淺，只能重建標本表面以下有限深度的微損傷，無法觀察到微裂紋的全貌以及骨組織的微結(jié)構(gòu)，同時標本的處理(染色、切片等)也是破壞性的。2.3.2 無創(chuàng)檢測方法micro-CT檢測骨微結(jié)構(gòu)：1972年Godfrey Hounsfield首先發(fā)明了CT技術，隨后CT被迅速應用于臨床；進入20世紀80年代，位于美國底特律的福特汽車公司為了探測材料中的結(jié)構(gòu)和應力缺陷，不斷改進CT技術，將CT的空間分辨率提高到了100 m以上，這從側(cè)面極大的推動了micro-CT的發(fā)展34；到了20世紀80年代后期，底特律地區(qū)的骨科研究者

39、們首先將micro-CT應用到了骨微結(jié)構(gòu)的研究中35-37；進入20世紀90年代以后，隨著商用micro-CT的出現(xiàn)(分辨率10-100 m)，骨微結(jié)構(gòu)的micro-CT研究也迅速增加。當前，micro-CT已成為骨微結(jié)構(gòu)無創(chuàng)檢查的常規(guī)方法。micro-CT相對于傳統(tǒng)的骨組織形態(tài)計量學方法有很多優(yōu)勢。首先，micro-CT檢測是相對無創(chuàng)的，它能夠獲取準確的影像數(shù)據(jù)且不破壞標本，在進行micro-CT檢查后，標本仍然可以做進一步的組織學或是化學、生物學檢測；其次，micro-CT所得的圖像分辨率高，能精確測定骨微結(jié)構(gòu)的三維形態(tài)參數(shù), 能夠測得真正意義上的骨密度。對比劑增強micro-CT檢測骨微

40、損傷：雖然micro-CT能夠較好的對骨微結(jié)構(gòu)進行掃描與三維重建，但對結(jié)構(gòu)更加微小的骨微損傷進行檢測有一定困難。為了在micro-CT掃描圖像中加強骨微損傷的顯像，人們開始嘗試使用對比劑。由于骨結(jié)構(gòu)本身在CT掃描中就表現(xiàn)為高CT值，因此對比劑的選擇有一定困難。2005年Leng等38嘗試使用“硫化鉛”作為對比劑檢測皮質(zhì)骨中的微損傷；2006年Parkesh等39-40嘗試使用“碘劑”作為對比劑對骨微損傷進行掃描，但他們使用的是自行合成的碘劑，且對微損傷的顯像效果欠佳；2007年Tang等41將原本用于掃描電鏡的“醋酸雙氧鈾”改用做micro-CT對比劑，獲得了較為理想的效果；2007年以及20

41、08年Leng等42以及Wang等43使用“硫酸鋇”作為對比劑分別對松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中的微損傷進行了micro-CT掃描，也獲得了較為理想的效果。相對于前幾種對比劑，硫酸鋇可能是相對合理且較有應用前景的選擇，因為當前臨床上普遍使用硫酸鋇作為對比劑進行胃腸道造影，即所謂“鋇餐”。2010年Turnbell 等44-45使用硫酸鋇做對比劑對皮質(zhì)骨微損傷進行了增強micro-CT掃描，并與傳統(tǒng)堿性品紅骨大塊染色法進行對比，發(fā)現(xiàn)增強micro-CT能夠無創(chuàng)的顯示微損傷的三維空間分布和積累過程，且其顯示結(jié)果與堿品骨大塊染色結(jié)果顯著相關，證實了硫酸鋇增強micro-CT方法的有效性；此后，硫酸鋇又被成功應用

42、于多個增強micro-CT研究，進一步體現(xiàn)了硫酸鋇作為對比劑應用于增強micro-CT檢測骨微損傷的可靠性。同步輻射光源micro-CT(synchrotron radiation CT，SRCT)：現(xiàn)有商用micro-CT在可以接受的檢測時長范圍內(nèi)，其空間分辨率在10-100 m。如果需要達到更高的空間分辨率則可能需要使用同步輻射光源。同步輻射光源是一種利用或正電子在磁場中偏轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的同步輻射的高性能新型強光源，它具有高純凈度和高亮度的特點。利用同步輻射光源的這些特性，將其應用于micro-CT掃描可以獲得極高的空間分辨率和信噪比。1993年同步輻射光源被首次推薦應用于micro-CT46

43、，此后，SRCT逐漸應用于骨微結(jié)構(gòu)研究47-50。目前世界各地的第3代同步輻射光源中心的空間分辨率可以到達1 m左右51，特殊設置下，其分辨率還可以提高到100 nm52。盡管SRCT相對于商用micro-CT有較大的優(yōu)勢，但同步輻射光源的產(chǎn)生需要昂貴龐大的設備，故進行SRCT掃描必須前往相關地區(qū)的同步輻射光源中心站點，這也限制了SRCT的廣泛應用。2003年Ito等53比較了SRCT、micro-CT和掃描電鏡對骨微結(jié)構(gòu)的掃描效果，結(jié)果顯示SRCT的三維重建圖像能夠顯示骨小梁表面的吸收陷窩，而它的二維掃描圖像可以反映骨結(jié)構(gòu)中不同位置的礦化程度，是研究骨微結(jié)構(gòu)的有力工具；2006年Thurne

44、r等54以及Larrue等55將SRCT應用于松質(zhì)骨破壞時微裂紋積累過程的觀察(分辨率3.5 m)；2009年Voide等56將SRCT應用于皮質(zhì)骨破壞時微裂紋發(fā)生發(fā)展過程的觀察(分辨率700 nm)，這些研究都表明SRCT是骨微結(jié)構(gòu)和微損傷檢測的理想工具。掃描電子顯微鏡：掃描電子顯微鏡發(fā)明于1965年，掃描電子顯微鏡使用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生二次電子發(fā)射，進而使用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)。由于掃描電子顯微鏡的原理是使用電子束掃描樣品表面并激發(fā)二次電子發(fā)射，因此掃描電子顯微鏡掃描要求樣品表面能夠?qū)щ?，對于骨和其他許多不導電的試樣，在掃描前需要進行鍍

45、膜處理，在材料表面形成一層導電膜。掃描電鏡的分辨率極高(< 1 m)，視野和景深大，成像富有立體感，可直接觀察試樣表面凹凸不平的細微結(jié)構(gòu)。上世紀70年代研究者們就開始使用掃描電子顯微鏡對骨微結(jié)構(gòu)進行研究57-58，現(xiàn)在人們常使用掃描電子顯微鏡在納米層級下觀察微損傷的超微結(jié)構(gòu)59-60。類似于增強micro-CT，為了加強微損傷的顯像，人們使用“硫化鉛”做對比劑對骨微損傷進行掃描電子顯微鏡掃描61，因為硫化鉛染色后可以使微損傷區(qū)域的電子密度增高，從而使顯像中微損傷的亮度增強。材料學中掃描電子顯微鏡常用于斷口分析，人們也應用掃描電子顯微鏡對骨折進行了斷口分析。1997年Braidotti等6

46、2使用掃描電子顯微鏡掃描檢測了皮質(zhì)骨的斷裂面；2007年Wise等63使用掃描電鏡對不同應變造成的骨折斷面進行了比較分析。在普通電鏡基礎上發(fā)展而成的“環(huán)境掃描電鏡”能夠?qū)щ姾筒粚щ姌悠愤M行高分辨率的靜態(tài)和動態(tài)觀察。2014年Carriero等64-65使用環(huán)境掃描電鏡觀察了小鼠的骨折線形貌，發(fā)現(xiàn)基因缺陷小鼠的骨折線表現(xiàn)為線性路徑，而野生型小鼠的骨折線會出現(xiàn)較多分叉。3 總結(jié) Conclusion 文章簡述了骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的基本概念，進而綜述了當前常用于骨微結(jié)構(gòu)和微損傷檢測的技術手段和設備，這些方法對于進一步深入理解骨微結(jié)構(gòu)和微損傷都十分重要。在實際研究中使用何種技術取決于需要獲得骨微結(jié)構(gòu)和

47、微損傷的哪些信息。堿性品紅骨大塊染色能夠快速有效的檢測和評估線性和彌散性微損傷，micro-CT和激光共聚焦顯微鏡能在微米層級對骨微結(jié)構(gòu)以及微損傷的三維形態(tài)進行分析，而掃描電鏡則能夠在納米層級檢測微損傷的細節(jié)，但無法觀察微損傷的整體形貌。應當在綜合使用力學實驗手段的同時靈活使用上述方法，以獲得骨微結(jié)構(gòu)和微損傷的各種相關信息，最終有助于在不同層級上理解骨微結(jié)構(gòu)和微損傷對骨質(zhì)量的影響。 致謝：感謝劉華教授、李明清與王成功醫(yī)師、李康華教授，在文章撰寫過程中提供指導與幫助。作者貢獻：許燦進行構(gòu)思設計、資料收集、綜述撰寫，劉華給予指導與建議。利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關利益沖突。倫理問題

48、：無涉及倫理沖突的內(nèi)容。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協(xié)議。4 參考文獻 References 1 Hui SL, Slemenda CW, Johnston CC Jr. Age and bone mass as predictors of fracture in a prospe

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