提取RNA常見問題

1、提取RNA原理及其常遇到的問題RNA提取一般步驟總結(jié)-E/ a% A-RNA提取原理：通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA,再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于 RNA酶無處不在，隨時(shí)可能將 RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方 需要注意，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。-M: d9 I3 8RNA提取的一般步驟4 e$ s" p+ 6 16 m* b所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核 蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源 RNA酶的有效抑制；有效地將 RNA從DNA和蛋白混合物中分離； 對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但

2、其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑：提取總核酸，再用氯化鋰將 RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下 DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而 RNA留在水相。第一種提取方法將 導(dǎo)致小分子量 RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。實(shí)驗(yàn)步驟：?1 i1 U& A% N% A!z破碎組織一分離 RNA一沉淀 RNA-洗滌 RNAf融解 RNAf保存 RNA。1、 破碎組織和滅活 RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸月瓜、硫鼠酸月瓜、NP-40、SDS蛋白酶K等破碎組織，加入 3 -ME可以抑制RNA酶活性。.|# j$ w) s- q5 r52、分離RNA一般用

3、酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心， RNA一般 分布于上層，和蛋白層分開。8 12 T) a" |" L. a# n3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2)或異丙醇。4、洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5、融解RNA 一般使用TE。6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量 RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、 肝臟)中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的 RNA,在水

4、中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的 RNA,在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量 RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄 本更敏感。為了增加貯存 RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將 RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于 -70C。用于保存 RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M , 12,000 Xg離心5分鐘。 氯化鋰法提取總 RNA:本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀 RNA,其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA,具有快速簡

5、潔的長處，但也存在少量 DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。試驗(yàn)試劑：1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,過濾滅菌】：_* I/t M+ w8 a# - K' N+ c/ a3 C2、懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS% c5 L+ z& ?2 b! y3 z+ t試驗(yàn)步驟：1、對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/ml),則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰尿素溶

6、液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。2 丫 x: p+ S& t" S- A'2、 勻槳液在0 4C放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘。 L0 O. B7 K' x; g- N& - R3、取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復(fù)步驟2。- k# S& m' j3 ) ?3 q( q4、沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置1530分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘。5、取上層水相，力口 1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及2倍體積的乙醇，20c放置1 小

7、時(shí)，5000g離心。6、 70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、 RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA,分裝，于70c保存。 植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相 應(yīng)對策! e-酚類化合物的干擾及對策：$ h6 Y2 j0 c* D- k l許多植物組織特別是植物的果實(shí)(如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等)和樹木類植物中富含酚 類化合物。酚類物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料 勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)(browning effec

8、t)。被氧化的酚類化合物(如醍類)能和 RNA穩(wěn)定 地結(jié)合，從而影響 RNA的分離純化。但 Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度和材料中酚類 物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合糅質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)(如原花色素類物質(zhì))是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其和 RNA 分開。6 g1 R7 c） （ f& U（ k% X防止酚類化合物被氧化的方法：1、還原劑法：一般在提取緩沖液中加入（-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時(shí)提

9、取液中（-疏基乙醇的濃度可高達(dá) 2%。（-疏基乙醇等還可以打斷多 酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過夜沉淀 RNA時(shí)加入（-疏基乙醇（終濃度1 %）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醍的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醍類化合物可被還原成多酚化合物。2、螯合劑法：螯合劑聚乙烯口比咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚毗咯烷酮（PVPP）中的CO N =基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以和PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚

10、氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在 pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多 酚的能力會(huì)迅速降低11。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要和其它方法結(jié)合使用。3、 Tris刷酸法：如果提取緩沖液中含有 Tris硼酸（pH7.5）,其中的硼酸可以和酚類化合物 依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其和RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以L6 pez-G6 mez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris測酸濃度過高（ 0.2M）則會(huì)影響RNA的回收率。9 O W（ V+ A'

11、P* Y e: - E9 O' B2 F$ M4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)和 BSA間可產(chǎn)生類似于抗原一抗體間的相互 作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)和RNA結(jié)合的機(jī)會(huì)，因此提高了 RNA的產(chǎn)量。BSA和PVPP結(jié)合使用提取效果會(huì)更好。由于BSA中往往含有 RNase,因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。.g2 D# o& D |; Z） z0 S; A/ A5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70C的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料， 可以有效地從云 杉、松樹、山毛棒等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA= %

12、 i2 v1 Y4 _; T/ f酚類化合物的去除 ：通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。和PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50%）來沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇 中而被除去。然后用含50% 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。多糖的干擾及對策：多糖的污染是提取植物 RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問題。植物組織中往往富含多糖， 而多糖的許多

13、理化性質(zhì)和RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成 RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀 RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有 多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性， 因此污染了多糖的 RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸月瓜處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過 LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過 這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖和RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化

14、時(shí)多糖污染的問題。l$ B1 U' j用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度 10%30%,可以使多糖沉淀下來，而 RNA仍保留于溶液中。一般都 是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取 RNA時(shí)， 在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度 10%以沉淀多糖。但 Tesniere等在從葡萄漿果組織中提 取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的 RNA溶液中加入終濃度 30%乙醇來沉淀多 糖的，進(jìn)一步純化了 RNA樣品。-h3 6 W3 ） R& L8 F另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多

15、糖法。Bahloul等在提取云杉組織的 RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖； Ainsworth在提取酸模植物花組 織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉 的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提 取某些植物材料的 RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如 L6 pez-G6 mez等在提取芒果 中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入 0.25體積的無水乙醇和 0.11體積的5M醋酸鉀溶液以 去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都

16、無效，只有兩者結(jié)合 使用效果最佳。 & X1 r4 _（ _1 B. BFang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的 NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹 RNA時(shí)， 緩沖?中NaCl的濃度為2.0M和1.0M ,通過氯仿抽提和乙醇沉淀 RNA將RNA和多糖分離。 Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM ,然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。蛋白雜質(zhì)的影響及對策：蛋白質(zhì)是污染 RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下

17、研磨植物材料以抑制 RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、月瓜、SDS 十六烷基三甲基澳化?。–TAB等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是 利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。Wilcockson利用蛋白質(zhì)和RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70%高氯酸鈉溶?中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來而能溶于 70%高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。+ N9 a+ 2 R8 R- Q6 )次級

18、代謝產(chǎn)物的影響及對策：從植物組織中提取高質(zhì)量 RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生 某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易和RNA結(jié)合并和RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個(gè)問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化葩梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的 RNA。+ V" j- f Z& " E由于植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組

19、織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會(huì)有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來說，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實(shí)踐才能確立。7 b# V* i! z$ 5 E隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基石的植物材料RNA提取過程中還會(huì)出現(xiàn)新的難點(diǎn)，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)工作者們一定會(huì)迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。植物

20、RNA提取中的一些特殊方法1d多酚類植物的RNA提?。禾O果棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。這個(gè)方法是驗(yàn)證過有效的，提取的RNA純度不是特別高，但是用作northern足夠。-I# h8 c& N9 i! ?(實(shí)驗(yàn)試劑：提取 buffer 200ml： NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0)EDTA5.8450g10mM SDS 2.0000g 1% NaOH 調(diào)至 8.0，定至 200ml,加 200ulDEPC融解.試驗(yàn)步驟：1、1.5ml離心管用液N2冷凍吼加入0.1g樣品，立即加入500ul酚氯

21、仿，再加入500ul提取buffer, 劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min。v8 C# N r9 " F7 丫2、4度12000rpm離心15min,上清轉(zhuǎn)入新管，加氯仿異戊醇抽提一次。$ I/ G( ?" p2 d6 L% Q;3、 取 600ul 異丙醇,-20 度沉淀 20min. s# A6 S- A3 i( d( b( t8 w4、 12000rpm 離心 10min。! y& X+ _3 f"j; k8 N/5、 沉淀用70度乙醇洗。6、 8000rpm 5min 。;J'_* J. U6 Cl'- R）7、沉淀晾干，溶于

22、30ulDEPC水。+ e2 , D5 n2 M* j0 X& r銀杏等木本裸子植物的RNA提取方法：5 c6 d & t） 銀杏、香機(jī)等木本裸子植物，酚類和多糖等次生物質(zhì)含量較多，對RNA的分離和純化有很大干擾，嚴(yán)重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，給相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行帶來阻礙。目前，RNA的提取方法很多，采取常規(guī)的Trizol試劑盒、SDS等方法不能提取銀杏 RNA,而Shujun Chang等（1993）的CTAB法，提取RNA質(zhì)量也較差，降解也十分嚴(yán)重。對其提取步驟 進(jìn)行改進(jìn)，得到質(zhì)量較高的銀杏 RNA樣品。，X7 U7 B5 yl m9 R, G:試驗(yàn)試劑：1 k

23、6 c- A1 u1 l& h5 R21、 1M tris:1 2.11g T ris ,溶于60m L水中，用濃鹽酸調(diào)至 Ph8 .0,定容至lOO mL.用滅菌的 DEPC水溶解。1 v9 Y8 N2 : z3 Q. A& x2 N4 r2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O力口入 80m L 水中，攪拌溶解，用 NaOH 調(diào) pH 至 8.0, 定容至 100mL。 3、 10 mollLLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL 水溶解即可。4、提取緩沖液（DEPC水處理）:2% CTAB（蛋白質(zhì)變性劑）.2% PVPK 30（去除多酚類物質(zhì)）10 0m M Tris-HCL （Ph8.0）2