02微生物實(shí)驗(yàn)室菌種管理規(guī)程(3.11審核)2

1、1、目 的：規(guī)范微生物試驗(yàn)用菌種的管理，確保菌種的有效使用。2、適用范圍：微生物試驗(yàn)用菌種的管理。3、責(zé) 任者：質(zhì)檢科負(fù)責(zé)人、微生物試驗(yàn)人員、菌種管理人員4、正 文：4.1概念a、標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。b、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。c、商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。d、工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。e、代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種 操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱(chēng)為一代。4.2 菌種的采購(gòu)和接收4.2.1 菌種的采購(gòu)4

2、.2.1.1 從藥檢所或菌種保藏中心等外單位購(gòu)入菌種斜面或凍干菌種。4.2.1.2 根據(jù)工作需要對(duì)購(gòu)買(mǎi)國(guó)內(nèi)保藏中心提供的菌種斜面提前1個(gè)月填寫(xiě)采購(gòu)申請(qǐng)單，凍干菌種提前2個(gè)月申請(qǐng)購(gòu)買(mǎi)，國(guó)外保藏中心提供的菌種應(yīng)提前3個(gè)月申請(qǐng)購(gòu)買(mǎi)。4.2.2 菌種的接收4.2.2.1 檢定菌應(yīng)設(shè)專(zhuān)人保管，管理人員應(yīng)接受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，有足夠的菌種保存經(jīng)驗(yàn)。4.2.2.2 接收菌種時(shí)，應(yīng)核實(shí)菌種的名稱(chēng)、編號(hào)、傳代代數(shù)、數(shù)量、有效期等，并調(diào)查清楚菌種 的保存條件和注意事項(xiàng)。接收時(shí)應(yīng)填寫(xiě)菌種接收登記表。內(nèi)容包括：菌種名稱(chēng)、菌種保藏中心編號(hào)、傳代次數(shù)、接收日期、菌種來(lái)源等。4.2.3 對(duì)新購(gòu)入的凍干菌種在使用前應(yīng)按要求對(duì)其進(jìn)行

3、生物形態(tài)確證試驗(yàn)和純度鑒定，由于新購(gòu)買(mǎi)的菌種斜面已由菌種提供單位做過(guò)生物形態(tài)確證試驗(yàn)和純度鑒定，所以傳代5代以?xún)?nèi)的菌種斜面不需要進(jìn)行純度鑒定。4.2.4 對(duì)新購(gòu)入的斜面菌種應(yīng)在28c保存，并應(yīng)在1周內(nèi)轉(zhuǎn)接。4.3 菌種的復(fù)蘇4.3.1 使用人員根據(jù)需要應(yīng)向菌種管理人員領(lǐng)取菌種，仔細(xì)核對(duì)標(biāo)簽上菌名、編號(hào)，并在菌種 接收及領(lǐng)用登記表上記錄菌名、數(shù)量、領(lǐng)用人、領(lǐng)用日期等信息。4.3.2 菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用。4.3.3 菌種復(fù)蘇應(yīng)在生物安全柜內(nèi)操作。4.3.4 常用菌種接種用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件表菌種名稱(chēng)接種用培養(yǎng)基培養(yǎng)條件大腸 國(guó) Escherichia coli營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3

4、0-35 18-24 小時(shí)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)短小芽抱桿菌Bacillus pumilus營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)藤黃微球菌 Micrococcus luteus營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)沙門(mén)菌 Salmonella營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊

5、脂培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)生抱梭菌 Clostridium sporogenes硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基30-35 C 18-24 小時(shí)白色念珠菌Candida albicans改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂23-28 C 24-48 小時(shí)黑曲霉 Aspergillus niger改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23-28 C 培養(yǎng)（5-7 天）4.4 菌種的傳代4.4.1 每株菌種應(yīng)建立菌種使用及傳代記錄，斜面菌種應(yīng)根據(jù)其特性決定傳代時(shí)間間隔。 各類(lèi)斜面菌種保藏溫度與傳代間隔時(shí)間表菌種保藏溫度傳代間隔時(shí)間細(xì)菌28 c每一個(gè)月移植一次放線(xiàn)菌28 c每2-4個(gè)月 移植一次酵母菌28 c每2個(gè)月移植一次

6、芽胞桿菌28 c每3個(gè)月移植一次霉菌28 c每3個(gè)月移植一次4.4.2 傳代時(shí)使用須核對(duì)名稱(chēng)、編號(hào)，傳代代數(shù)及日期，所用培養(yǎng)基傳代和接種規(guī)程4.4.2.1 控制傳代次數(shù)，傳代次數(shù)越多，突變的幾率越大，因此要盡量少傳代；根據(jù)菌種特性和 實(shí)際保存情況，最多傳代不超過(guò)5代，超過(guò)此次數(shù)，應(yīng)加熱滅活，菌種有異常情況或有雜菌生長(zhǎng)，則應(yīng)隨時(shí)更代。4.4.2.2 菌種的傳代應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。,取其中1支重復(fù)4.4.2.3 在規(guī)定的彳存期內(nèi)，取5代以?xún)?nèi)的菌種管（瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物） 接種斜面培養(yǎng)基，制備下一代工作菌種用于傳代。4.4.3 傳代和接種規(guī)程4.4.3.1 先點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁的上部空間操作，

7、燒灼接種環(huán)。4.4.3.2 再將原有的菌種斜面培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)菌種管）與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)接種管） 持在左手拇指、食指及中指之間，要注意能清楚地觀(guān)察到斜面，菌種管在前，接種管在后，應(yīng) 斜持試管呈45。角，使試管內(nèi)斜面向上，兩試管口平齊，注意不要持成水平，以免管底凝集水 浸濕培養(yǎng)基表面。4.4.3.3 首先，以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管的棉塞，以便接種時(shí)易于拔取。再以右手持接種環(huán)的柄 端，垂直或稍斜地把接種環(huán)在火焰上燒灼。頂端的環(huán)必須燒紅，以徹底滅菌。環(huán)以上凡接種時(shí) 可進(jìn)入試管的部分，也應(yīng)通過(guò)火焰燒灼。燒灼時(shí)，應(yīng)把環(huán)置于酒精燈的外焰上，因外焰的濃度 比內(nèi)焰高，容易燒紅。4.4.3.4 使用右手的

8、小指和手掌之間以及無(wú)名指與小指之間，在火焰旁分別拔出兩支試管的棉塞，持住，再將試管口在火焰上通過(guò)，以殺滅管口可能沾污的細(xì)菌，但勿燒燙。4.4.3.5 先將燒灼過(guò)的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基土，如有熔印則表明接種環(huán)未冷卻能燙死細(xì)菌。一定待冷后，再?gòu)男泵嫔咸羧【ι僭S，取出時(shí)接種環(huán)不能通過(guò)火焰,應(yīng)從火焰旁迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線(xiàn)接種。劃線(xiàn)時(shí)，一般先由下而上劃一直線(xiàn)后， 再由下而上劃曲線(xiàn)。操作過(guò)程應(yīng)迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。4.4.3.6 當(dāng)接種完畢，立即將管口通過(guò)火焰滅菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要將管口離開(kāi)火焰 旁去迎接右手的棉塞。最后將接種環(huán)燒灼滅菌放置原處，再把

9、可能未塞緊的棉塞塞緊，即可進(jìn) 行培養(yǎng)。4.4.3.7 操作過(guò)程中，如因不慎使棉塞觸及火焰而著火，卻勿用口吹，須在剛剛著火時(shí)迅速塞入試管，因管內(nèi)氧氣不足會(huì)很快熄滅。若棉塞外端著火，可用手捏熄。若棉塞燒壞不宜再用，可另取未接種斜面培養(yǎng)基上的滅菌棉塞，代替塞上。4.4.3.8 接種完畢，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、短小芽抱桿菌、沙門(mén)菌、生抱梭菌在30-35C培養(yǎng)18-24小時(shí)，白色念珠菌在 23-28C培養(yǎng)24-48小時(shí)，黑曲霉在23-28 C培養(yǎng)（5-7天）。實(shí)驗(yàn)室4.4.3.9 傳代和接種使用后，應(yīng)填寫(xiě)菌種傳代、使用記錄，并記錄傳代菌種實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。+傳代代數(shù)（一位數(shù)字

10、）+菌種編號(hào)由以下內(nèi)容組成：傳代日期（年兩位十月兩位十日兩位） 序號(hào)（兩位數(shù)字）知識(shí)就是力量*如：130312-4-01表示13年3月12月接種的第四代第 1支菌種管4.4.3.10 最后貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽應(yīng)有菌種名稱(chēng)、保藏中心編號(hào)、實(shí)驗(yàn)室編號(hào)、有效期。4.5 菌種的保藏4.5.1 凍干菌種在低溫冰箱-20C冷凍。4.5.2 為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成無(wú)菌橡膠塞，放在2 C-8 c左右的冰箱內(nèi)保藏。4.5.3 在保藏前，應(yīng)貼上菌種標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括菌名、菌號(hào)、傳代日期和有效期。4.5.4 每天檢查一次保存菌種的冰箱溫度，并作記錄，每周檢查菌種管的棉塞是否松動(dòng)

11、，菌種外觀(guān)及干燥狀態(tài)，如有異常應(yīng)及時(shí)處理，并填寫(xiě)菌種檢查記錄。4.5.5 每次移植培養(yǎng)后，要與原種的編號(hào)、名稱(chēng)逐一核對(duì)，確認(rèn)培養(yǎng)特征和溫度無(wú)誤后，再繼續(xù)保存。4.6 菌種的使用和銷(xiāo)毀4.6.1 受污染的菌種、過(guò)期菌種或菌種傳代使用后應(yīng)及時(shí)銷(xiāo)毀，銷(xiāo)毀時(shí)應(yīng)經(jīng)121c高壓蒸汽滅菌30分鐘的生物滅活處理。記錄、附錄、參引文件清單序號(hào)名稱(chēng)編R1外購(gòu)菌種接收、領(lǐng)用登記表SOP-QCP00101002-Red01-002菌種檢查記錄SOP-QCP00101002-Red02-003菌種傳代、使用及后處理情況表SOP-QCP00101002-Red03-00變更記錄文件編號(hào)變更內(nèi)容生效日期SOP-QCP00101002知識(shí)就是力量育港喜 奇港塞1*帝塞1*言菌種檢查記錄菌種名稱(chēng) ：記錄編號(hào)：SOP QCP00101002- Red02-00菌種名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)室編號(hào)檢查人及日期功效期檢查情況備注保臧中心編P來(lái)源接收人及日期入庫(kù)數(shù)量領(lǐng)用人及日期保管