南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生化課件RNA生物合成

1、DNA的復(fù)制復(fù)制部位：真核生物：原核生物：細(xì)胞質(zhì)dATP n2dCTPDNA 聚合酶.ctc( " DNA+ (nrio+no+nJ PPin3d GTPDNA模板1 2 3 4，n4d TTP JPPi隨即被焦磷酸酶水解，從而推動聚合反應(yīng)的進(jìn)行。（二）復(fù)制的方式半保留復(fù)制DNA復(fù)制時，親代DNA的雙螺旋先解旋并分開,然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，各形 成一條互補(bǔ)鏈。這樣，從親代的一個DNA雙螺旋分 子復(fù)制成兩個與親代的堿基序列完全相同的子代 DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈來自親 代DNA,另一條則是新形成的，這樣的復(fù)制方式叫做半保留復(fù)制(semiconserva

2、tive replication )。(-)復(fù)制的方式半保留復(fù)制Afrrr onr. V.cr mo(二)復(fù)制的方式一.DNA的復(fù)制如何證明半保留復(fù)制1958年，Meselson 證明：用，nh4cl唯一氮源培養(yǎng)大腸桿菌，之后，用i4|MH4a培養(yǎng)，然后進(jìn)行 CsCIz進(jìn)行密度梯度離心。由于15NH4cl密度大于 14nh4cl因此，形成不同區(qū)帶，經(jīng)過若干代培養(yǎng) 后，兩個14NH4cl區(qū)帶增多。（=）復(fù)制反應(yīng)注意點.DNA的復(fù)制CsCl梆度親代中-DNABX,5N -DNAl4N -DNA,4N,15N -DNA(-)復(fù)制的方式,5N -DNA（重）DNAOngiual parvnlmolec

3、ule|4N.I5N -DNA（中等）Hybrid DNA （15N_14Ni First-fteneration daughter molecules7 ,4N -DNA、（輕）l4N, l5N-DNA（中等）Socond-goneraUon daughter moleculesLight DNArNi Hybrid DNADNA的復(fù)制CsCl梯度親代,JN -DNA,4N?5N -DNAw,5N-DNA（£）|4NJ5N-DNA仲等）一弧-DNA,4NJ5N -DNAMN -DNA（輕）,4Nt ,5N-DNA（中等）一味 -DNA半保留復(fù)制全保留復(fù)制DNA復(fù)制除入DNA聚合酶，

4、DNA模板， dNTP外，還需要多種蛋白質(zhì)因子、引物 、Mg2+等.特點：A對利福平不敏感B核糖核酸代替脫氧核糖核酸（四）參與復(fù)制的碎和蛋白質(zhì)：一.DNA的復(fù)制1. DNA聚合酶（DNA polymease）DNA聚合酶原核生物DNA聚合酶IDNA聚合酶nDNA聚合酶m催化活性53，35，5，f3z聚合 核酸外切核酸外切+功能切去引物RNA,補(bǔ)上正確的DNA片段與修復(fù)有關(guān)（活性低）負(fù)責(zé)鏈的延長（活性高）TABLE 25-1 Comparison of DNA Polymerases of E. coliDNA polymeraseIIIIIStructural gene*polApolBpol

5、C (dnaE)Subunits (number of different types)17N10103,00088f000f791,5003f >5r Exonuclease (proofreading)YesYesYgs5'3' ExonucleaseYesNoNoPolymerization rate (nucleotldes/s)16-2040250-1.000Processlvlty (nucleotides added3-2001,500三500,000before poMnerase dissociates)More than 90 % of the DNA

6、 polymerase activity obsen edin E. coli extracts can be accounted for by DNApolymerase I(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制TABLE 25-2 Subunits of DNA Polymerase III of F. coliNumber ofsubunits perSubunit holoenzyme Mr of subunit Gene Function of subunit129.90027,500poiC (dnaE) dnsQ (mutO)Polymerization activity3&

7、#39;f 5' Proofreading exonuclease, Core polymerase8.600holEA71,100dnaXStable template blndlig: core enzyme dimerizationClamp-loading (7) complex that47.500dnaXClamp loaderloads fi subunits on lagging38,700holAClamp openerstiund at each Okazaki fragment36.900holBClamp loader16.600holCInteraction

8、with SSB15.200holDInleractlon with y anc x40,600dnaNDNA clamp required foroptimal processMVDNA polymerase III is much more complex than DNApolymerase I, having ten types of subunits（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)I .DNA的復(fù)制p clampii clamp (open)（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)2. DNA聚合酶(DNA polymease)催化活性功能DNA聚合酶 5-3' 3, 一 5， 5Z - 3,聚

9、合 核酸外切核酸外切真核生物DNA聚合酶aDNA聚合晦。DNA聚合悔DNA聚合酶5+切去引物RNA,補(bǔ)上正確的DNA片段負(fù)責(zé)鏈的延長負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈的延長5, Primer strand1 () 力 CH”,(>HOH<>OIIIIp (> p - <>-1'171)廠(廠()()5| CH” <C1Ircmplale-X>«iscTBaseyBA1Bas<Basc-»_Mismatched /ybasesExonuclease ( hydrolysis site.rr!DNA polymerase 1Every ce

10、ll contains several different nucleases （核 酸酶），belonging to two broad classes: exonucleases （核 酸外切酶）and endonucleases （核 酸內(nèi)切 酶）. Exonucleases degrade nucleic acids from one end of the molecule.核酸夕卜切 Exonucleases degrade nucleic acids from one end of the molecule> Many operate in only the 5 '一

11、 3 ' or the 3'5' direction, removing nucleotides only from the 5' or the 3' end, respectively, of one strand of a doublestranded nucleic acid or of a single-stranded DNA>（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì).DNA的復(fù)制Endonucleases can begin to degrade at specific internal sites in a nucleic acid strand

12、or molecule, reducing it to smaller and smaller fragments. A few exonucleases and endonucleases degrade only singlestranded DNA. There are a few important classes of endonucleases that cleave only at specific nucleotide sequences.Nick弋子 RNA ur DNA（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)53'3,535，dNTPs53' 53I忖Template D

13、NA strandDNA polymerase IdNMPsorrNMPb5, -3,核酸外切5,一. DNA的復(fù)制DNA Replication Requires Many Enzymes andProtein FactorsReplication in E. coli requires not just a single DNA polymerase but 20 or more different enzymes and proteins, each performing a specific task. The entire complex has been termed the DN

14、A replicase system or replisome> The enzymatic complexity of replication reflects the constraints imposed by the structure of DNA and by the requirements for accuracy.（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制DNA Replication Requires Many Enzymes andProtein FactorsTABLE 25-3 Proteins Required to Initiate Replication

15、at the £ coll OriginNumber ofProteinMrsubunitsFunctionDnaA protein52,0001Recognizes on sequence: opens duplex at specific sites inoriginDnaB protein (helicase)300,0006*Unwinds DYADnaC protein29.0001Required for DnaB binding at odglnHU19.0002Histonellke protein: DNA-blndlng protein: stimulates I

16、nitiationPnmase (DnaG protein)60,0001Synthesizes RNA primersSingle-stranded DNA-bindingprotein (SSB)75,6004.Binds single-stranded DNARNA polymerase454,0005Facilitates )naA activityDNA gyrase (DNA topoisomerase II)400,0004Reliefs to sional stiam generated by DNA unwindingDam methylase32,0001MetTylale

17、s (5'>GATC sequences at oriC（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.引物酶（primer）合成RNA引物,又叫引物合成酶、引發(fā)酶。它以單鏈DNA為模板，以ATP、GTP、CTP、UTP 為原料，從方向合成出RNA片段，即引物。（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)3. DNA連結(jié)酶（DNA ligase）催化DN4雙鏈中一條鏈上的缺口（3'-OH與 它下游相鄰的核甘酸的5-磷酸之間）共價連結(jié)（ 形成磷酸二酯鍵）。連結(jié)過程需要能量，和某些細(xì)菌中由 NAD+提供；動物細(xì)胞由ATP提供。（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一,DNA的復(fù)制4. DNA連結(jié)酶(DNA

18、ligase)Nirotinainidc or nu »noniiclcoti<le (卜:qW)(phage T4>(ctikarvotcs)or ATP(phage* *1 I) (ciikai veiled)Adenosine ()XI l23r$Xi< k<<d 1) !：於:Ni< kr<l l>N (四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì).DNA的復(fù)制5. 使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)；解螺旋酶(helicase):將DNA的兩條鏈打開。每解開一對堿基需要 水解2分子ATP。方向為3 -3，,大腸桿菌中的 解螺旋酶又叫rep蛋白，但方向

19、為3，-5，。(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì).DNA的復(fù)制4.使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)；單鏈結(jié)合蛋白(SSBP):與解鏈后的DNA單鏈結(jié)合，阻止其再次形成雙 螺旋。大腸桿菌S6B為177 aa多肽，以四聚體形 式存在，與32個bp DNA區(qū)相結(jié)合，結(jié)合后的DNA 分子僵硬，不易 彎曲，有利于單鏈DNA分子的穩(wěn) 定，避免核酸酶進(jìn)攻；同時降低了Tm值，進(jìn)一步 促進(jìn)DNA的解鏈。（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)-DNA的復(fù)制4使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)* 旋轉(zhuǎn)酶（gyrase,untwisting protein）： 催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化?？煞譃橥?fù)洚悩?gòu)酶I和拓?fù)洚悩?gòu)酶n。I型酶可減少負(fù)超

20、螺旋；II型酶可引入負(fù)超螺旋（ 此時需要ATP提供能量）。具有內(nèi)切酶和連接酶活力 ,參與DNA復(fù)制前雙螺旋的松弛及復(fù)制后超螺旋的再 恢復(fù)。（四）參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)三DNA的復(fù)制4使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)* dnap蛋白（mobile promoter）：功能：識別DNA的合成的起始位置，與引物酶及其 它一些蛋白組成復(fù)合體啟動RNA引物鏈的合成。（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制1 .復(fù)制的啟動復(fù)制從特定的位點開始，這一位置叫復(fù)制原點°原核生物的DNA上一般只有一個復(fù)制原點，但在 迅速生長時期，第一輪復(fù)制尚未完成，就在起點處啟 動第二輪復(fù)制；真核生物則有多個復(fù)制原點，可以同時啟動復(fù)

21、制 過程。（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制2 .復(fù)制的啟動復(fù)制過程的調(diào)控主要取決于復(fù)制啟動的頻率， 而DNA延長的速度大體上是恒定的。由于真核生物 在多位點上啟動復(fù)制，所以盡管其DNA比原核生物 DNA大得多，但復(fù)制的總速度反而比原核生物快。DNA的復(fù)制是由引發(fā)體識別并結(jié)合于復(fù)制原點 而被啟動的，其機(jī)理比較復(fù)雜，目前還不十分明了DNA的復(fù)制（五）復(fù)制的過程3 .復(fù)制眼的形成由于復(fù)制原點都是在DNA分子的內(nèi)部，而不是在 末端，所以當(dāng)復(fù)制啟動后需要在復(fù)制原點處將DNA雙 螺旋局部解鏈，形成“眼狀”結(jié)構(gòu)復(fù)制眼。DNA的復(fù)制（五）復(fù)制的過程2 ,復(fù)制眼的形成 復(fù)制眼的結(jié)構(gòu)：復(fù)制眼形成后，其兩端的叉子狀結(jié)

22、構(gòu)稱為復(fù)制叉。（五）復(fù)制的過程| . DNA的復(fù)制2 .復(fù)制眼的形成-雙螺旋解開的過程解螺旋酶使DNA雙螺旋局部解鏈；SSB結(jié)合到解開的單鏈上；拓?fù)洚悩?gòu)酶n向DNA中引入負(fù)超螺旋，以消除由 解鏈產(chǎn)生的扭曲張力（動畫）。雙螺旋DNAX切開雙璉中公Topi X的一條鏈形（-）q ：；成DNA-磷酸結(jié)合Topi酪紈共價鍵3，5，1帶切開的3'端單鏈穿越 與另一條連Top 1被解離2個負(fù)超螺旋DNA-醐中間物(b)切斷后面（+） 的雙能(-)雙上鏈口 的至斷封 斷起原接 切穿與連(c)（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制3 .復(fù)制叉的推進(jìn) （1）復(fù)制叉推進(jìn)的方式隨著復(fù)制叉的推進(jìn)，兩條新鏈的合成方向是

23、不同的：一條鏈延伸的方向與復(fù)制叉前進(jìn)的方向一致，它的合成 能連續(xù)進(jìn)行，稱為前導(dǎo)鏈；（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的方式另一條鏈延伸的方向與復(fù)制叉前進(jìn)的方向 相反，它顯然不能被連續(xù)合成，需要復(fù)制叉推 進(jìn)了 一定的長度，有了一段DNA單鏈后，才能 以此為模板合成一個片段。因此這條新鏈的合 成是不連續(xù)的，而且總晚于先導(dǎo)鏈，所以稱為 隨后鏈。（五）復(fù)制的過程DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的方式這種前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的 方式，稱為半不連續(xù)復(fù)制。隨后鏈中合成的多個DZA片段，稱為岡崎 片段。岡崎片段的長度原核細(xì)胞中約 10002000個核昔酸，真核細(xì)胞中約

24、 1。200個核昔酸。（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的過程先導(dǎo)鏈的合成引物酶在復(fù)制原點附近合成一段RNA 引物；DMA聚合酶in （原核細(xì)胞）在引物的 3末端逐個添加脫氧核甘酸。隨著復(fù)制叉的推進(jìn)，親代DNA雙螺 旋不斷被解開，先導(dǎo)鏈也不斷延伸。（五）復(fù)制的過程.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的過程隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個岡崎片段都需要合成 RNA引物。也是由引物酶催化。岡崎片段的合成：DNA聚合酶m（原核細(xì)胞）在引物的 3'末端使DNA鏈延伸，直至抵達(dá)其 下游的另一個岡崎片段的RNA引物 的51端。（五）復(fù)制的過程I . DNA的復(fù)制3

25、.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的過程隨后鏈的合成岡崎片段的連結(jié)：DNA聚合酶I 一面以其DNA聚合活 性在上游岡崎片段的3，OH末端添加 脫氧核甘酸，一面以其5,一3,核酸外 切活性切除引物，直至將引物全部切 除。DNA連接酶將最后的缺口補(bǔ)好。（五）復(fù)制的過程I . DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進(jìn)-復(fù)制叉推進(jìn)的過程 先導(dǎo)鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個DNA聚合酶ID全酶二聚體催化隨后鏈的模板回折成環(huán)，從而使岡崎片段的延伸 方向與先導(dǎo)鏈的延伸方向一致，它們的31末端分別落 在DNA聚合酶ID全酶的雙活性部位。因此，隨著聚合 酶的移動，兩條鏈同時延伸。SSBRNA primerDnaB helicaseDNA primascDNA topoisomerase II (DN.ALeading strand synthesis <DMA polymerase 111)cation fork movement3'5Lagging strand 3一 5"RNA primer frum previous Okazaki fragment（五）復(fù)制的過程4 .復(fù)制的結(jié)束rLagging strand synthesis(DNA jM