測(cè)定脯氨酸藥品配制及操作

1、測(cè)定脯氨酸藥品配制及操作一、藥品二、試驗(yàn)用具電子天平、燒杯、蒸餾水、容量瓶(250ml) 1個(gè)、50ml容量瓶6個(gè)、試管6支(制作標(biāo)曲應(yīng)用)、水浴鍋、試管若干、藥品、標(biāo)簽、研缽、稱量紙、注射器。三、溶液配制酸性茚三酮溶液：將茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，攪拌加熱(70C) 溶解貯于冰箱中。6mol/L磷酸：濃度為85%的磷酸大約是14mol/l，如果要配置 6M的磷酸大約稀釋到原 來(lái)體積的倍即可。3%的磺基水楊酸： 3g 磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。冰醋酸甲苯四、試驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(1) 在分析天平上精確稱取25 mg 脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用

2、少量蒸餾水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每毫升含脯氨酸100 yg(2) 系列脯氨酸濃度的配制取 6個(gè)50 ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液，及ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1, 2, 3, 4, 5及6卩g -mil(3) 取 6 支試管，分別吸取 2 ml 系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及 2 ml 冰醋酸和 3 ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30 min。表 2-5 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線表試劑1系列 Pro溶液 (mL)2冰醋酸2酸性印三酮溶液2Pro 含量2234562222222222222224681012(4) 冷卻后各試管

3、準(zhǔn)確加入 5 ml甲苯，振蕩30 s,靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。(5) 用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照， 于 520 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。(6) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸濃度(X)而變的回歸方程式， 再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2 ml測(cè)定液中脯氨酸的含量(卩g -ml'1)。2、莖脯氨酸含量的測(cè)定(1) 脯氨酸的提?。好總€(gè)樹(shù)種隨機(jī)取當(dāng)年生莖段若干段,用去離子水洗凈后,每個(gè)重復(fù)稱取莖段g,剪碎，分別置大管中，共3個(gè)重復(fù)。然后向各管分別加入5 ml 3 %的磺基水楊酸溶液,管口加蓋玻璃球塞,在沸水浴中提取 10 m

4、in, (提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)使脯氨酸迅 速釋放 ),取出試管冷卻至室溫待用,冷卻后即為脯氨酸的提取液。(2) 吸取 2 ml 提取液于另一干凈的帶玻塞試管中,加入 2 ml 冰醋酸及 3 ml 酸性茚三酮冷卻后加入5 ml甲苯，充分搖蕩30 s，靜置片刻。（取上層液至10ml的離心管中，在 3000r/min 下離心 5min）（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光 光度計(jì)上520 nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2 ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（Xy g21-1），然 后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。配合公式（8）計(jì)

5、算莖脯氨酸含量：X V脯氨酸含量（y/g ）=/1000000（8）FW A式中：X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得脯氨酸濃度（yg）, V為提取液總體積（5 ml）, FW為針葉的質(zhì)量（g）, A為測(cè)定時(shí)所吸取的體積（2 ml ）。五、注意事項(xiàng)1. 酸性茚三酮溶液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，或配好后貯于4 C冰箱中2-3d可用。2. 提取過(guò)程中應(yīng)注意經(jīng)常搖動(dòng)大管，以使脯氨酸提取徹底。3. 反應(yīng)液中各試劑需按順序加入。植物體內(nèi)脯氨酸含量的高低是反映植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一i。植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時(shí)，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，并且 積累指數(shù)與品種的抗逆性有關(guān)。植物的抗寒性與脯氨酸的

6、含量存在相關(guān)性ii。游離脯氨酸的抗寒性作用是調(diào)節(jié)和維持結(jié)凍前融凍后原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，促進(jìn)蛋白質(zhì)與水的結(jié)合，增加蛋白質(zhì)的可溶性iii。游離的脯氨酸可以提高植物組織液的濃度，降低結(jié)冰點(diǎn)，從而起到保護(hù)細(xì)胞、 組織的作用。因此可以認(rèn)為脯氨酸含量可以作為衡量植物體的抗 寒性的指標(biāo)。游離脯氨酸累積對(duì)植物抗逆性的生理作用表現(xiàn)在：（1）作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；（2 ）作為脫水劑；（3）作為氮源的貯藏形式，并作為植物受環(huán)境脅迫時(shí)植物生物氨的解毒劑；（4）作為呼吸底物或能源物質(zhì)iv。脯氨酸區(qū)別于其他構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，它可以促進(jìn)蛋白質(zhì)水合作用， 親水、疏水表面的相互作用，脯氨酸含量的增多使可溶性蛋白

7、增多，其原因是促進(jìn)蛋白質(zhì)膠體的親水面積增大。 從而，植物受到低溫脅迫時(shí)，脯氨酸增多進(jìn)而使植物抗性增大達(dá)到自我保護(hù)的作用。有研究表明，抗逆性強(qiáng)的植物在受到外界環(huán)境脅迫時(shí)積累的脯氨酸量多于抗逆 性弱的植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)積累游離脯氨酸的量，由此看來(lái)，植物體內(nèi)積累游離脯氨酸的量可以作為評(píng)價(jià)植物抗逆性的一個(gè)生理指標(biāo)v,vi。吳國(guó)訓(xùn)等人在對(duì)刨花楠對(duì)低溫響應(yīng)的研究中，通過(guò)對(duì)游離脯氨酸含量的變化和電導(dǎo)法測(cè)定刨花楠抗寒性比較發(fā)現(xiàn)，游離脯氨酸可以作為評(píng)價(jià)植物抗逆性的指標(biāo)112。有研究者認(rèn)為，脯氨酸含量的增加可以降低小麥葉片滲透 勢(shì)，防止細(xì)胞脫水vii。也有研究者認(rèn)為，植物體內(nèi)游離脯氨酸的積累量與其所受的脅迫程

8、 度呈正相關(guān)，因此可以作為植物所受脅迫強(qiáng)弱的指標(biāo)。韓蕊蓮viii等人的研究表明，游離脯氨酸的連續(xù)積累對(duì)提高植物抗逆性有著一定的幫助。本研究中隨著脫鍛煉的進(jìn)行，6種觀賞植物的抗寒性下降，游離脯氨酸的含量也隨著下降(圖6)，與韓蕊蓮的研究結(jié)果一致。由此在本研究中，游離脯氨酸的含量可以作為評(píng)價(jià)此6種觀賞樹(shù)種抗寒性的一項(xiàng)指標(biāo)。i 職明星，李秀菊脯氨酸測(cè)定方法的改進(jìn)J.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,4(33)10-12.ii Cleff MD. Proline accumulation during the environmental stressJ. Crop Scienee, 1983, 23(1):

9、23-26.iii 湯章成.逆境條件下植物體脯氨酸的累積及可能意義J.植物生理學(xué)通訊，1984, (1):15-27.iv 羅華健,劉星輝.水分脅迫條件下枇杷若干生理指標(biāo)的變化J.亞熱帶植物科 學(xué),2004,33(1):19-21.v 吳國(guó)訓(xùn)，吳田兵，查寶源,等.低溫脅迫對(duì)刨花楠苗期細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)及生理生化物質(zhì)的影響J.江西林業(yè)科技,2008, 4, 14-16.vi 王寶山.生物自由基與植物膜脂傷害J.植物生理學(xué)通訊，1988,24(2):12-16.vii Sun J-Y, Zhao Y-T. Study on the p rotective function and mechanism of cellwall glycoproteins i