蛋白質(zhì)變復(fù)性

1、目錄一、 脲和鹽酸胍在包涵體蛋白質(zhì)純化中的作用二、 包涵體變復(fù)性三、 包涵體洗滌純化710四、包涵體提出、純化和復(fù)性一、二、包涵體變復(fù)性包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等?；拘畔⒅形拿Q包涵體變復(fù)性復(fù)性方法稀釋復(fù)性 原 因基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高包涵體變性破菌 洗滌 溶解目錄1包涵體2包涵體變性3包涵體復(fù)性包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RN

2、A聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1m，具有很高的密度(約1.3mg/mL)，無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。包涵體的形成原因主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。1.基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高，超過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵

3、體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。2.重組蛋白的氨基酸組成:一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。3.重組蛋白所處的環(huán)境:發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。4.重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。5.蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對(duì)于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如Aspa

4、rtase和Cyanase,表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。6.在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。包涵體變性破菌基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用:機(jī)械破碎、超聲破碎:單純超聲破碎，在小規(guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解,然后以5000-20000g 15min離心，可

5、使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。洗滌溶解一般用強(qiáng)的變性劑如尿素(6-8M)、鹽酸胍(GdnHCl 6M)，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長期保溫時(shí)?；蛴萌ス竸鏢DS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。Kandula Suntha等人用TritonX-100來溶解Zymononas mobilis levansucras

6、e包涵體蛋白。另外還，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。包涵體復(fù)性由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理?xiàng)l件

7、，使蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到2M 左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。包涵體蛋白復(fù)性方法包涵體蛋白復(fù)性效率復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾，如

8、在純化IL-2時(shí)以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子(0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2)的方法，25-37°C下反應(yīng)3小時(shí)，再EDTA至1m mol/l終止反應(yīng)，復(fù)性后的二聚體低于1%。6一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度:正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml;如果變性蛋白加入復(fù)性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復(fù)性液中始終處于低濃度狀態(tài)。pH和

9、溫度:復(fù)性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的二硫鍵的形成，過高或過低會(huì)降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-9.0。此外，影響復(fù)性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。提高包涵體蛋白的復(fù)性產(chǎn)率氧化-還原轉(zhuǎn)換系統(tǒng)對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程應(yīng)能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有:空氣氧化法、使用氧化交換系統(tǒng)、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.最常用的氧化交換系統(tǒng)是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSS

10、G、DTE/GSSG等也都有應(yīng)用。氧化交換系統(tǒng)通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應(yīng)提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10:1-5:1。添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊，但可能通過破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質(zhì)的輔因子Zn2+或Cu2+可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體,從而防止了蛋白質(zhì)的聚集，加入濃度大于0.4 mol/lT

11、ris緩沖液可提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度。成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。PEG-NaSO4兩相法用PEG和NaSO4作為成相劑,然后加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質(zhì)溶液加入其中進(jìn)行復(fù)性,但這種方法需復(fù)性的變性蛋白質(zhì)的濃度必須低。分子伴侶和折疊酶等這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰-輔氨酰順反異構(gòu)酶、分子伴侶、FK506結(jié)合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。其它提高復(fù)性率的策略還有許多，如

12、:非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用;待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助其復(fù)性;多聚離子化合物如肝素不僅可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的作用，而且具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用。10折疊復(fù)性效果的檢測根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。凝膠電泳:一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。光譜學(xué)方法:可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜

13、(CD)等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。色譜方法:如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，生物學(xué)活性及比活測定:一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。黏度和濁度測定:復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。免疫學(xué)方法:如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。在正常的生理?xiàng)l件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨(dú)特的方式進(jìn)行

14、折疊，形成自己特有的空間結(jié)構(gòu)，以執(zhí)行某一些生命活動(dòng)。當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯(cuò)誤剪接和運(yùn)輸，錯(cuò)誤折疊和異常聚積，形成對(duì)機(jī)體有害的反應(yīng)，引起構(gòu)象病的發(fā)生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對(duì)包涵體形成和復(fù)性過程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚，許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個(gè)例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律:如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導(dǎo)、聚集具有相對(duì)特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識(shí)建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復(fù)興性的方法。相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在

15、不久的將來，預(yù)測和設(shè)計(jì)最佳復(fù)性方案將成為可能。3.包涵體的洗滌純化1 包涵體洗滌試劑 1.1 裂解液 50mmol/L Tris·Cl（pH7.2），10mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl.。 1.2 Buffer I 20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，100mM NaCl。 1.3 2M/4M/8M 尿素溶液 分別稱取2mol/4mol/8mol的尿素，用Buffer I定容至1L即可。 2 工程菌的大量表達(dá) 從平板上挑生長飽滿的單克隆菌落接種于25ml LB（含抗生素），37振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)菌液按1:1000擴(kuò)種，至裝有500ml

16、 LB（含抗生素）的1000ml三角培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)的瓶數(shù)根據(jù)需要而定。37振蕩培養(yǎng)，至OD600nm 1.0左右。使菌液冷卻，加IPTG至終濃度為0.2mmol/L，25，誘導(dǎo)6hr。收集菌體，4，10,000g離心4min。以培養(yǎng)液體積的1/50量的裂解液懸浮。冰浴，用超聲破碎儀或高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體。超聲條件為：輸出功率70%，作用2sec、間歇4sec為一個(gè)脈沖，共作用時(shí)間累計(jì)30min/100ml裂解液。同時(shí)保留上清和沉淀部分，分別制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。 3 包涵體的洗滌純化 l 包涵體沉淀以裂解液等體積的2% Triton X100（Buffer I溶解）重懸，37，振蕩30m

17、in。 l 4，8,000g，離心10min，沉淀以等體積的Buffer I重懸，超聲波處理5min/100ml懸浮液。 l 4，8,000g，離心10min，沉淀以等體積的2% Triton X100（Buffer I溶解）重懸，37，振蕩30min。 l 4，8,000g，離心10min，沉淀以等體積的Buffer I重懸，37，振蕩30min。 l 4，8,000g，離心10min，沉淀以等體積的2mol/L尿素溶解，室溫?cái)嚢?0min。 l 4，8,000g，離心10min，上清液為目的蛋白的2M尿素樣品；沉淀以等體積的4mol/L尿素溶解，室溫?cái)嚢?0min。SDS-PAGE檢測目的

18、蛋白所在組分。 l 4，8,000g，離心10min，上清液為目的蛋白的4M尿素樣品；沉淀以等體積的8mol/L尿素溶解，室溫?cái)嚢?0min。SDS-PAGE檢測目的蛋白所在組分。 l 4，12,000g，離心10min，上清液為目的蛋白的8M尿素樣品，SDS-PAGE檢測目的蛋白所在組分。蛋白樣品基本上都能溶解于8M尿素，棄沉淀。 4 蛋白質(zhì)的復(fù)性方法 4.1 透析復(fù)性 將包涵體的4M尿素變性置于透析袋中，注意透析袋中盡可能不留氣泡，再將透析袋放入裝有20倍以上蛋白樣品體積的復(fù)性液（如PBS溶液）的燒杯中，在預(yù)設(shè)環(huán)境溫度（4、25和37等）下，用磁力攪拌器中速地?cái)嚢鑿?fù)性液，以加速溶液的滲透和

19、擴(kuò)散。每隔一定的時(shí)間（4時(shí)約3-4hr，25，27約2-3hr）換一次等量新鮮的復(fù)性液，共4次。透析袋內(nèi)的樣品經(jīng)4，12,000g，離心10min，上清即為目的蛋白的復(fù)性液，沉淀視情況進(jìn)行回收再復(fù)性。如透析至PBS中樣品沉淀了，可以逐步透析至4M尿素，2M尿素，PBS中。復(fù)性液可進(jìn)一步用其它方法進(jìn)行檢測，短期保存可貯存于4，常期保存則置于-20或-80。4.2 切向流復(fù)性 根據(jù)目的蛋白的分子量，選擇膜包的合適截留分子量（常用的有5kD、10kD和30kD等），按儀器的操作說明將膜包、樣品容器和壓力計(jì)用無吸附硅膠軟管相連，其中的部分軟管繞過蠕動(dòng)泵。根據(jù)膜包的洗滌程序，用規(guī)定的溶液洗滌膜包，最后以

20、蛋白變性液的溶劑平衡管道系統(tǒng)，將預(yù)過濾（0.22µm的微孔濾膜過濾）的樣品液（包括復(fù)性添加劑等）倒入樣品容器中，若有需要，開動(dòng)蠕動(dòng)泵將樣品的蛋白濃度濃縮到預(yù)定的值。整個(gè)系統(tǒng)，包括樣品和復(fù)性緩沖液，預(yù)先平衡至預(yù)定的環(huán)境溫度（4、25和37等），將復(fù)性緩沖液連入系統(tǒng)的濾過液補(bǔ)償接口，開動(dòng)攪拌系統(tǒng)，緩慢啟動(dòng)蠕動(dòng)泵至1L-1.2L/min的流速，測量切向?yàn)V過液的流速，調(diào)節(jié)系統(tǒng)反壓閥以控制濾過速度達(dá)到預(yù)期值，并確認(rèn)復(fù)性液被濾過造成的負(fù)壓吸入以更換變性緩沖液。待濾過液的體積達(dá)到20倍樣品的體積時(shí)，撤離復(fù)性緩沖液，回收樣品經(jīng)4，12,000g，離心10min，上清即為目的蛋白的復(fù)性液，沉淀視情況進(jìn)

21、行回收再復(fù)性。按規(guī)定洗滌膜包的殘留物，并將膜包充滿含0.05%NaN3的弱堿性溶液，存放于4。復(fù)性液可進(jìn)一步用其它方法進(jìn)行檢測，短期保存可貯存于4，常期保存則置于-20或-80。 若帶GST標(biāo)簽的目的蛋白表達(dá)在上清中，可以選擇過GST柱。若表達(dá)在包涵體中，可以通過洗包涵體，復(fù)性純化。若需進(jìn)一步提高純度，可以采用電洗脫方法純化，但電洗脫純化的蛋白是變性用且不可復(fù)性的?？梢試L試改用PET32a載體表達(dá)，目的蛋白表達(dá)至上清中的可能性將提高。四、 包涵體提出、純化和復(fù)性下列方法已在本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，復(fù)性任何包涵體，必定能得到目的蛋白：菌體為超聲法裂解，裂解溶液中含50mM Tris-HCl, pH 8.0

22、，100mM NaCl，5mM EDTA，0.1% NaN3，0.5% Triton-X100，在使用前加入 0.1mM PMSF每250毫升裂解液中加入約50克菌體，工作15s，間隔15秒，超聲破碎45分鐘，超聲后加入10mM MgSO4 和0.1mg/ml 的溶菌酶和Dnase 0.01mg/ml，室溫放置20分鐘，6000RPM離心15分鐘，保留沉淀。再次加入裂解液，超聲破細(xì)胞后，加溶菌酶和Dnase, 上述過程重復(fù)三次。用下述的溶液將包涵體懸浮，離心收集包涵體。50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN3用下述溶液懸浮包涵體，離心收集

23、包涵體。50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN31M 尿素如暫時(shí)不用，放入20保存。包涵體的溶解將包涵體懸浮在下述溶液中，4振蕩過夜。100mM Tris50mM Glycine8.5M 尿素溶液用HCl調(diào)節(jié)到pH 8.0后加入25mM DTT6000RPM離心，取上清，去除不溶解物。包涵體蛋白的復(fù)性將溶解的包涵體裝入透析袋，在4下將透析袋浸入下列溶液依次透析：0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF4M 尿素 溶液pH調(diào)節(jié)到8.0透析24小時(shí)0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF2M 尿素 溶液pH調(diào)節(jié)到8.0