最新微生物菌種資源純度檢測技術規(guī)程

1、微生物菌種資源純度檢測技術規(guī)程目次前 言 2引 言 31 范圍 42 術語、定義、縮略語和符號 43 菌種的純度檢測 4參考文獻 8前言本規(guī)范由科學技術部農村與社會發(fā)展司提出。本規(guī)范起草單位： 中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所、 中國科學院微生物研究所、 中國林 業(yè)科學研究院森林保護研究所、 中國藥品生物制品檢定所、 中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研 究所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。本規(guī)范主要起草人：張曉霞、姜瑞波、顧金剛、康孟佼、李世貴、張瑞穎、阮志勇、周 宇光、樸春根、葉強、張月琴、陳敏、程池等。引言微生物菌種資源種類繁多， 需要針對不同的微生物類群建立簡便有效的形態(tài)學、 生物化

2、 學等標準化的純度檢測技術。 微生物菌種純度檢測是微生物菌種進行鑒定、 保存、 評價和利 用的前提條件，是確保鑒定結果的準確性和資源保藏質量的基本保障。制定本規(guī)程的目的是為健全質量保證管理體系， 保證微生物菌種資源的質量， 規(guī)范各類 微生物菌種資源純度檢測。微生物菌種純度檢測技術規(guī)程1 范圍本規(guī)程規(guī)定了古菌、細菌、真菌、病毒（種）純度檢測的程序和方法。 本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機構、大學、企業(yè)、個人等。2 術語、定義下列術語和定義適用于本規(guī)程2.1純度檢測 purity check指通過適當的方法檢測菌種是否為純培養(yǎng)物。2.2純培養(yǎng) pure culture由單個細胞的后代組

3、成的培養(yǎng)物， 即單細胞培養(yǎng)物或無性繁殖系。 通常是由挑取單個菌 落或利用單胞分離技術，移種繁殖獲得。3 菌種的純度檢測3.1 古菌和細菌的純度檢測3.1.1 菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上， 將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線， 適宜培養(yǎng)后， 同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應 再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復出現(xiàn)相同特征。3.1.2 細胞形態(tài)對數生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應應呈現(xiàn)一致性； 細胞形狀、 大小、 莢膜等特征應相 似3.1.3 芽孢大小、位置、形狀宜檢測樣品是否形成芽孢，對形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應相似

4、。3.2 放線菌菌種純度檢測3.2.1 菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線 , 挑取單菌落，適宜培養(yǎng)后， 在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質地、光澤、顏色等應相似。如懷疑為細菌污 染，則 30液體培養(yǎng) 24小時，培養(yǎng)液不應渾濁，如渾濁則視為細菌污染。3.2.2 培養(yǎng)特征分別接種三種以上培養(yǎng)基， 在三種以上培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征應想同， 包括氣生菌絲、 基 內菌絲、可溶性色素的顏色等。3.2.3 孢子絲及孢囊在特定的培養(yǎng)基、 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間等條件下， 孢子著生方式、 孢子絲形態(tài)及其顏色 或孢囊著生位置（氣絲或基絲）、孢囊的形狀，大小應呈現(xiàn)出一致性。3.3 酵母菌種

5、純度檢測3.3.1 菌落形態(tài)應對菌落形態(tài)相似性進行檢測。 在特定的培養(yǎng)基上， 通過對待檢測菌株進行稀釋或劃線 涂布平板獲取單菌落，一定的培養(yǎng)條件下，比較同一平板內，菌落的大小、形狀、顏色、隆 起、表面狀況、質地、光澤等應一致。3.3.2 個體形態(tài)應對檢測樣品的個體形態(tài)進行檢測。 在指定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下， 細胞形狀、 大小及 細胞的增殖方式應一致。3.3.3 繁殖方式酵母繁殖的方式應一致，如是芽殖，出芽的方位、數量應一致。3.4 絲狀真菌菌種純度檢測3.4.1 菌落特征菌落的形態(tài)等表觀特征應一致。3.4.2 菌絲特征在特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌絲分隔、菌絲形態(tài)等應一致。3.4.3 其他主要

6、顯微特征應一致3.4.4 檢測是否有細菌污染3.4.5 對于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術獲得純培養(yǎng)物進行對比，其菌 絲、孢子等特征應與原始菌株的描述一致。3.5 病毒的純度檢測3.5.1 純粹檢查應將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（ G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過一定溫度時間培養(yǎng)后，檢查結果應無細菌生長為純粹。3.5.2 支原體檢查檢測由禽胚組織或其細胞所培養(yǎng)的病毒應用改良 Frey 氏培養(yǎng)基。檢測其它培養(yǎng)方法所得 病毒應用支原體培養(yǎng)基。 任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落， 判為陽性。 陽性對照中至少 有一個平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，

7、則檢驗有效。3.5.3 外源病毒檢查病毒類制品在毒種選育和生產過程中， 經常使用動物或細胞基質培養(yǎng)， 因此， 有可能造 成外源因子 （特別是外源病毒因子） 的污染。 為了保證制品質量， 需要對毒種和細胞進行外 源因子檢測。3.5.3.1 病毒種子批外源因子檢查對病毒主種子批或工作種子批， 應抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行病毒外源因子 檢測。在試驗前應用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體） ，所用的抗體免疫源 應采用與生產疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細胞（或動物）制品。如果病毒 曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應來自 SPF 雞群。 以下方法

8、可以選擇一種或多種進行。3.5.3.1.1 動物試驗法3.5.3.1.1.1 小鼠試驗法取 15 20g 小鼠至少 10 只，用經抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內接種0.03ml ，同時腹腔接種 0.5ml。至少觀察 21 天。在觀察期內至少有 80最初接種的小鼠存活，試驗 才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗 24 小時后死亡或有患 病體征的小鼠， 直接觀察期病理改變， 并將有病變的相應的組織懸液通過腦內和顱腔接種另 外至少 5 只 15 20g小鼠，并觀察 21 天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.1.2 乳鼠試驗法取出生后 24 小時內的乳鼠

9、至少 10 只，用經抗血清中和后的病毒懸液， 腦內接種 0.01ml ， 同時腹腔接種至少 0.1ml 。每天觀察，至少 14 天。在觀察內至少有 80最初接種的乳鼠存 活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗 24 小時后死 亡或有患病體征的乳鼠， 直接肉眼觀察其病理改變， 并取有病變的相應的組織和腦、 脾制備 成懸液通過腦內和腹腔接種另外至少 5 只出生后 24 小時內乳鼠，并每天觀察至接種第 14 天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.2 細胞培養(yǎng)法3.5.3.1.2.1 非血吸附檢查用經抗血清中和后的病毒懸液， 接種于生產用的同種的細胞。

10、 細胞至少接種 6 瓶，每瓶 病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25。于 36±1培養(yǎng)，觀察 14 天，必要時可更換細胞培養(yǎng)液，未見細胞病變（ CPE）為陰性，符合要求。3.5.3.1.2.2 血吸附病毒檢查上述接種病毒的各個細胞于第 6 8天后和第 14天，取出 2瓶進行血吸附病毒檢查。 用 0.2 0.5%雞和豚鼠紅細胞混合菌懸液覆蓋于細胞表面，分別置于28，2025， 30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性，符合要求。3.5.3.1.3 雞胚檢查法在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用 911 日和57 日齡兩組 SPF雞胚，每組至少 5 只，

11、分別于尿囊腔和卵黃囊接種經抗體血清中和后的 病毒懸液，每胚 0.5ml 。孵育 7 日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細胞混合懸液做血球凝集試驗 應為陰性。被接種的雞胚至少 80存活 7 天，試驗有效。3.5.3.2 生產用細胞外源因子檢查3.5.3.2.1 細胞直接觀察每批生產用細胞應留取 5（或不少于 500ml ） , 細胞懸液不接種病毒，作為對照細胞 加入與疫苗生產相同的細胞維持液，置于與疫苗生產相同的條件下培養(yǎng)，觀察 14 天，在顯 微鏡下觀察是否有細胞病變（ CPE）出現(xiàn)，無細胞病變（ CPE）出現(xiàn)者為陰性，符合要求。在 觀察期末至少有 80的對照細胞培養(yǎng)物存活，試驗有效。3.5.3.2.

12、2 血清吸附病毒檢查對生產用細胞外源因子檢查的（ 1）項細胞培養(yǎng)物在觀察期末取至少25的細胞培養(yǎng)瓶進行血吸附病毒檢查。 （方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）參考文獻1 劉志恒，姜成林主編 .放線菌現(xiàn)代生物學與生物技術 . 北京：科學出版社 ,Pp1-353. 20042 楊蘇聲主編 . 細菌分類學 . 北京：中國農業(yè)大學出版社 ,Pp1-145.19973 沈萍，彭珍榮主譯 . 微生物學 ，第五版，中文版 , 高等教育出版社， 20044 中國科學院微生物研究所 常見與常用真菌 編寫組 . 常見與常用真菌 . 北京： 科學出版 社 ,P1-317 ，19785 中國科學院微生物研究所菌種保藏手冊編著組 . 菌種保藏手冊 . 北京：科學出版 社 ,P1-839 ，19806 David R. Boone et al. Bergey' s Man