生物技術(shù)實驗

1、實驗一 酵母細(xì)胞的固定化1.實驗?zāi)康恼莆战湍讣?xì)胞的固定化方法。2.原理利用固定包埋法將酵母物細(xì)胞用物理的方法包埋在載體之中。這種方法既操作簡單，又不會明顯影響生物活性，是比較理想的方法，目前應(yīng)用最多。其理想的固定化載體應(yīng)是應(yīng)對微生物無毒性，傳質(zhì)性能好，性質(zhì)穩(wěn)定，不易被生物分解，強度高、壽命長，價格低廉等。通常選用海藻酸鈣、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝膠、光硬化性樹脂、聚乙烯醇等。3.試劑和儀器設(shè)備鮮酵母、海藻酸鈉、無水氯化鈣，燒杯、尼龍布、注射器帶7號平針頭、攪棒、恒溫水浴、試管、分光光度計4.實驗步驟（1）稱取海藻酸鈉0.75g于100mL燒杯中，加25mL蒸餾水?dāng)噭?，在沸水浴中溶?5min，

2、得A液。（2）取一個50mL燒杯，加入鮮酵母5g和25 mL餾水，攪勻，得B液。（3）待A液冷卻后，將B液與A液混合，用尼龍布過濾，得C液。（4）稱取2.2g無水CaCl2，溶解于200 mL蒸餾水中。（5）用注射器帶7號平針頭將C液垂直注入CaCl2溶液中制備固定化細(xì)胞，固化30min，過濾、洗滌，稱重。5.實驗數(shù)據(jù)及其處理記錄固定化酵母細(xì)胞的質(zhì)量。固定化酵母細(xì)胞的質(zhì)量為：0.75g6.問題討論如何驗證固定化酵母細(xì)胞的催化能力？ (1) 觀察制作的凝膠珠的顏色和形狀 如果制作的凝膠珠顏色過淺，呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定化的酵母細(xì)胞數(shù)目較少。如果形成的凝膠珠不是圓形或者橢圓形，則說明

3、海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗。 （2）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生很多氣泡，同時會聞到酒味。（3）檢查凝膠的黏性和彈性。 思想感悟經(jīng)過這次酵母細(xì)胞的固定化實驗，我不僅掌握了酵母細(xì)胞的固定化方法，同時也通過對注射器的使用，明白了固定化細(xì)胞時，針頭應(yīng)垂直于液面且保持較近的距離，同時注射時速度應(yīng)相應(yīng)提高，以保證自液面下落的固定化酵母直徑較小，因為緩慢低價會導(dǎo)致在流出針頭時，由于黏彈力會使液體聚集形成較大的液滴，而快速注射形成水流則會避免該現(xiàn)象。 實驗二 蛋白的酶解及水解度的測定1實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗，要求掌握酶水解蛋白質(zhì)和測定水解度的原理，并掌握蛋白質(zhì)水解度的測定方

4、法。2原理（1）蛋白質(zhì)酶水解. 蛋白質(zhì)的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定條件下對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行催化水解，使蛋白質(zhì)大分子降解成不同鏈長的小分子。與酸堿催化的水解反應(yīng)相比，它的反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，水解效率高。酶水解蛋白質(zhì)主要受溫度、pH值、加酶量、底物濃度及反應(yīng)時間的影響。根據(jù)不同的蛋白水解酶及底物情況，可設(shè)定不同的水解條件進(jìn)行反應(yīng)，作比較后，選擇最佳的反應(yīng)條件。（2）水解度測定方法當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的肽鍵全部被水解生成氨基酸時，則水解度為100，沒有被水解時，其水解度為0。由于蛋白質(zhì)水解時每裂解一個肽鍵就生成一個-NH2和一個-COOH基，因此，在測定蛋白質(zhì)水解度時，只要定量的測定新生成的-NH2和

5、-COOH基的量就可以計算出h值，這樣就可以算出蛋白質(zhì)的水解度。常見的測定水解度的方法有甲醛固定法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(TNBS)、三氯乙酸法和pH-STAT法。本試驗采用茚三酮法測定蛋白質(zhì)的水解度，其原理如下：茚三酮在弱酸性溶液中與氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反應(yīng)生成氨，茚三酮、反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原性茚三酮共同反應(yīng)，生成紫色化合物。利用化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定570nm處的光密度，測定氨基酸的含量。3.試劑和儀器設(shè)備(1) 材料：地鱉酶解液(2) 試劑：10NaOH 溶液、標(biāo)準(zhǔn)L-亮氨酸（固體）、1SDS溶液、0.2125M的磷酸緩沖溶液（pH8.2）、茚三

6、酮、KIO3、0.1N的HCl溶液、Arazyme蛋白酶(5000U/g)(3) 儀器設(shè)備：粉碎機、磁力攪拌機，pH計、離心機、旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器、紫外可見分光光度計、分析天平、電子秤、移液管（1mL、10mL）4實驗步驟： 試劑的配制 0.5mmol/L甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備：準(zhǔn)確稱取37.53mg甘氨酸定容至1000mL容量瓶中，于0條件下保存?zhèn)溆?；甘氨酸?biāo)準(zhǔn)使用液制備: 分別吸取上述溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于試管中，用蒸餾水補足至1mL，相當(dāng)于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L； 碘酸鉀KIO3稀釋液制備：稱取1.0g碘酸鉀溶于蒸餾水中并稀釋

7、至300mL，再加入200mL95%乙醇溶液，混勻備用； 茚三酮顯色劑制備：稱取0.5g茚三酮，用95%乙醇溶解并定容至100mL，此溶液在低溫條件下用棕色試劑瓶可保存兩周。 pH 5.4，2mol/L醋酸緩沖液：A 2mol/L醋酸 20mL冰醋酸加入到173mL蒸餾水中，混勻；B 2mol/LNaAc 50gNaAc用305mL蒸餾水溶解，混勻；用A將B調(diào)節(jié)到pH 5.4。 原料處理選取干地鱉蟲或榨油后的水分含量低，用粉碎機以60目過篩對原料進(jìn)行粉碎。 加水調(diào)酸：每次取粉碎好的原料5.0g放入250mL的三角瓶中，按料水比1：20加蒸餾水到三角瓶中，將料液混勻。用10NaOH溶液調(diào)節(jié)料液的

8、pH值到8.2，混勻。 酶解：向已調(diào)pH值的料液中加入Arazyme蛋白酶0.3000g，將三角瓶置入旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器內(nèi)，在37、150r/min進(jìn)行酶解。 滅酶：水解1小時后，取出三角瓶在80下滅酶15min。 離心分離：5000r/min下離心10min，倒出上清液即水解液，稀釋20倍備用。 水解度的測定：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取25mL磨口具塞比色管6支，分別加入甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，再向各管分別加入pH5.4 2mol/L醋酸緩沖液，茚三酮顯色劑各1.0mL，再向各管中加入蒸餾水，使各管的總體積為5.0mL，搖勻、蓋塞、在沸水浴中加熱15min后，取出，用冷水冷卻15min，再向各管中加

9、入5.0mL KIO3稀釋液并搖勻，30min后于570nm測其吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：濃度mg/L0.10.20.30.40.5OD值0.0750.0870.1390.1500.220y=2.6409x-0.0544R2=0.9322 測定水解液的水解度：取水解液1.0mL，再向各管分別加入pH5.4，2mol/L 醋酸緩沖液，茚三酮顯色劑各1.0mL，再向各管中加入蒸餾水，使各管的總體積為5.0mL搖勻、蓋塞、在沸水浴中加熱15min后，取出，用冷水冷卻15min，再向各管中加入5.0mLKIO3稀釋液并搖勻，30min后于570nm波長處測其吸光度。5.實驗數(shù)據(jù)及其處理水解度（Degre

10、e of hydrolysis,DH）是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水解的百分?jǐn)?shù)，其計算公式為：DH= h / htot ×100%令x=0.563 y=1.43H= =1.91mmol/gh - 蛋白質(zhì)水解后每克蛋白中被裂解的肽鍵的毫摩爾數(shù)（mmol/g蛋白質(zhì)）htot- 每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)（mmol/g蛋白質(zhì)） 據(jù)實驗結(jié)果表明，大豆蛋白（Soy protein）, 酪蛋白（Casein），明膠蛋白（gelatin）中肽鍵的毫摩爾數(shù)各為7.75，8.0，11.1mequiv/g，而花生蛋白或花生粕蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)，到目前還沒有實驗結(jié)果的推薦值。但是，利用一種底物進(jìn)行酶解，選擇最

11、佳反應(yīng)條件時，htot是固定不變的，產(chǎn)生變化的是根據(jù)不同反應(yīng)條件下水解后每克蛋白中被裂解的肽鍵的毫摩爾數(shù)。所以，本實驗可以用h來表示蛋白質(zhì)水解程度。據(jù)測定，干地鱉蟲蛋白質(zhì)含量在60%以上，以60%計；花生粕的蛋白質(zhì)含量為39.752%，計算時以40%來計算。(參考Adler-Nissen, Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzensulfonic acid ,1977)6問題討論 以花生粕作為水解原料的意義在哪里？充分利用花生壓榨制油后的資源，而且花生粕蛋白質(zhì)

12、營養(yǎng)價值高,含量高達(dá)40%.氨基酸配比合理，富含人體必須氨基酸。 在國內(nèi)食品加工中常用的蛋白質(zhì)分解酶是什么？胃蛋白酶，凝乳酶，胰蛋白酶、組織蛋白酶 從韓國引進(jìn)的高效蛋白質(zhì)分解酶Arazyme的特點是什么？Arazyme酶是蜘蛛腸道中分離出的共生微生物所分泌的一種高效金屬蛋白酶。特點：蛋白分解能力，更有效的分解動植物蛋白質(zhì)，耐受高溫，低溫、較寬的PH范圍；具有一定的抗菌活性；有高效率的催化能力，具有高度專一性，作用條件較溫和，生物效應(yīng)是瞬時的。 本實驗中的注意事項是什么？1.實驗中要用具塞比色管的目的是為了加熱時確保安全。   2.使用醋酸緩沖液是為了給顯色反應(yīng)創(chuàng)造環(huán)境。&#

13、160;  3.花生粕的蛋白質(zhì)含量為39.752%，計算時以40%來計算思想感悟經(jīng)過這次蛋白的酶解及水解度的測定實驗，我不僅學(xué)到了酶水解蛋白質(zhì)和測定水解度的原理，還學(xué)到了蛋白質(zhì)水解度的測定方法。蛋白的酶法水解就是利用蛋白水解酶催化水解，使蛋白質(zhì)大分子降解成不同鏈長的小分子。而測定其水解度則需要依靠茚三酮法，生成的紫色化合物在570nm下測定的光密度，得出氨基酸的含量。另外，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，為了獲得更為準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)線，需要舍去誤差較大的數(shù)據(jù)，為今后的實驗數(shù)據(jù)處理積累了經(jīng)驗，而使用醋酸緩沖液創(chuàng)造顯色環(huán)境也為提供了一定的參考。實驗三 酶解物肽含量的測定1.實驗?zāi)康碾S著對多肽生理功能認(rèn)識的深入

14、，多肽的提取及含量的測定也具有重要的意義。本實驗主要目的是掌握利用BCA法測定肽含量的方法及原理。2實驗原理二價銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)分子中的肽鍵還原成一價銅離子，一價銅離子和獨特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。3.試劑和儀器設(shè)備（1）原料和試劑原料：地鱉蟲酶解物或花生粕酶解物，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，蒸餾水試劑：0.9% NaCl：稱取2.25gNaCl，用蒸餾水定容

15、至250mL； 0.5mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)液 移取2.5mL 5mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，加入0.9%NaCl稀釋至25mL，既得0.5mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)液； 稀釋酶液：取地鱉酶解液（工藝同實驗三）加入，加入等體積的10%TCA混勻，靜置10min，3000rpm離心15min，取上清液，稀釋10倍，備用。（2）儀器設(shè)備恒溫水浴鍋、分光光度計、pH計、移液槍、分析天平、秒表或定時鐘。4.實驗步驟：（1）將試劑A搖勻，用10mL移液管移取10mL試劑A到小試劑瓶中，用移液槍向其中加入200uL的試劑B（即試劑A與試劑B的量要滿足A:B=50:1）,充分混勻。BCA工作液在室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定

16、。（2）取0.5mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加0.9%NaCl補足1mL。即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mLBSA標(biāo)準(zhǔn)液。（3）取各標(biāo)準(zhǔn)液100uL，加入1mLBCA工作液，充分混勻，于37OC水浴中放置60min，取出后在562nm波長下讀其吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）樣品液測定：取3支試管，1號加入100uL蒸餾水，2、3號試管加入100 uL稀釋后樣品，再向其中分別加入1mL BCA工作液，充分混勻。將試管于37OC水浴中放置60min，取出后在562nm波長下讀其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定含量。5.實驗數(shù)據(jù)及處理肽含量根據(jù)

17、樣品液的吸光值及BCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。標(biāo)準(zhǔn)曲線:濃度mg/mL0.10.20.30.40.5OD值0.0930.1220.2790.3440.411y=1.1218X+0.02R2=0.9602樣品23平均OD值0.6130.5790.596令X=0.596則y=1.1218×0.596+0.02=0.6896.問題討論（1）測定肽含量的意義在哪里？多肽是由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物，測定其含量可以得知多肽的氨基酸種類及數(shù)量，從而分析其生理功能；（2）BCA試劑混合時注意事項有哪些？1.根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BC

18、A工作液，充分混勻。2.BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。 3.為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)?shù)挠梦⒉t加熱，但是切勿過熱。附錄：注意事項：1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在充分混勻后在稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。2、由于在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時吸取量非常小，要注意移液槍加液的精確。3、試劑A和試劑B混合成工作液時，可能會有混濁，但充分混勻后就會消失，成為淡藍(lán)色的透明溶液。4、BCA蛋白定量試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保無EGTA，EDTA低于10mM，二硫蘇糖醇低于1mM，B-基乙醇低于1mM。不適用BCA法時建議使用Bradford法蛋白定量試劑盒。還可以考慮用超純水稀釋，透析或除鹽，ACETO

19、NE/TCA沉淀蛋白后重溶于超純水等方法來消除干擾物質(zhì)的影響。5、為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)?shù)挠梦⒉t加熱，但是切勿過熱。6、如果發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景，應(yīng)考慮使用Bradford法蛋白定量試劑盒。思想感悟經(jīng)過這次酶解物肽含量的測定實驗，我學(xué)到了利用BCA法測定肽含量的方法。從而也了解到，蛋白質(zhì)作為人體的組成成分，作為人體必需的營養(yǎng)素之一，其強大功能的背后是氨基酸的多樣性，本次實驗測定肽含量就為了解分析蛋白質(zhì)的功能特性提供了方法，同時，本次試驗中使用了移液槍，也使我熟悉了移液槍的使用方法。實驗四、蛋白酶活力的測定（Folin-酚法）1實驗?zāi)康恼莆沼肍olin-酚

20、法測定蛋白酶活力的方法。2原理蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660nm測定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。酶活單位定義：在37、相應(yīng)的pH條件下，在1min內(nèi)水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克酚類化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，為1個酶活單位。3主要儀器和試劑（1）試劑和溶液 0.1mol/L HCl：取濃鹽酸17mL，加水稀釋并定容至100mL，即為2mol/L鹽酸溶液；取100m

21、L 2 mol/L鹽酸溶液，定容2000mL，即為0.1mol/L鹽酸溶液； 1mg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液精確稱取預(yù)先于105 oC干燥至恒重的L-酪氨酸0.5g，用適量鹽酸溶解后，再用蒸餾水定容至500mL，即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液吸取1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 mL用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL,即得到100 g/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取100g/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成L-酪氨酸濃度分別為0、10、20、30

22、、40、50g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 0.55mol/L NaCO3：稱取29.2057g NaCO3 定容至500mL容量瓶中； 福林（Folin）試劑：使用時，以1份原Folin試劑與2份蒸餾水混勻，制成稀Folin試劑； PBS緩沖液（pH 7.6）：NaH2PO4溶液：準(zhǔn)確稱取0.6060g NaH2PO4,用蒸餾水定容至100mL，Na2HPO4溶液：準(zhǔn)確稱取1.7924gNa2HPO4,用蒸餾水定容至250mL；將NaH2PO4溶液緩慢滴入Na2HPO4溶液中用磁力攪拌器攪拌，用pH計測其pH值至7.6； 1mol/L NaOH：準(zhǔn)確稱取2.0833g NaOH,用蒸餾水定容至50mL

23、； Casein溶液： 稱取1.21gCasein加入到PBS緩沖液160mL，在50-60oC水浴中攪拌，加重蒸水定容至200mL，用1N NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH至8.5； 6M醋酸：準(zhǔn)確移取17.257mL冰乙酸，重蒸水定容至50mL； TCA溶液：TCA 1.8g，無水醋酸鈉1.8g，6M醋酸5.5mL，重蒸水定容至100mL； 待測酶液的制備：稱取1.0g Arazyme酶溶于100mL蒸餾水中，稀釋100倍備用。（2）儀器、設(shè)備恒溫水浴鍋、分光光度計、pH計、分析天平、秒表或定時鐘。4實驗步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按照表1分別吸取不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.55mol/L碳酸鈉溶液和稀

24、Folin試劑于各管中，混勻。將各管同時置于37oC水浴，反應(yīng)30min，取出，迅速冷卻至室溫，以空白管（0號管）為參比，在660nm測吸光度。以酪氨酸量為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)吸光度為1時的酪氨酸量（g）即為比色常數(shù)K值。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時方可使用（否則須重做）。對每個新配制的Folin試劑制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線管號標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸使用溶液0.55mol/L碳酸鈉溶液(mL)稀Folin試劑(mL)濃度（g/mL）吸取量（mL）002.05.01.01102.05.01.02202.05.01.03302.05.01.04402.05.01.05502.05.01.02樣品的測定取三支15×150mm試管（一支空白管，二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入5mL casein基質(zhì)液，將三支試管放入37oC水浴中預(yù)熱5min，分別向二支樣品管加入1.0mL 稀釋酶溶液，準(zhǔn)確計時，反應(yīng)30min，取出。迅速準(zhǔn)確向三支試管中加入5mL TCA，空白管先加TCA再加稀釋酶溶液，搖勻。將三支試管繼續(xù)置37oC水浴中放置30min，取出，迅速冷卻至室溫。三支試管中反應(yīng)液用濾紙（Whatman4號濾紙）過濾。另取三支15×150