天津大學生物化學課件Lecture08Enzymes

1、酶酶第五章第五章 酶酶 酶的概念酶的概念 酶的分類與命名酶的分類與命名 酶的化學本質(zhì)酶的化學本質(zhì) 酶的結構與功能的關系酶的結構與功能的關系 酶作用的專一性酶作用的專一性 酶的作用機制酶的作用機制 酶促反應的速度和影響因素酶促反應的速度和影響因素 酶活力的測定酶活力的測定 酶的制備酶的制備 酶的應用酶的應用酶的概念酶的概念 酶是生物催化劑酶是生物催化劑 酶的特點酶的特點: 1) 催化效率高催化效率高; 2) 高度的專一性高度的專一性; 3) 對環(huán)境條件極為敏感對環(huán)境條件極為敏感 新陳代謝的調(diào)控多是通過酶來進行的新陳代謝的調(diào)控多是通過酶來進行的酶的命名酶的命名CHOHCH3COO-+ NAD+CC

2、H3COO-O+ NADH + H+EC 1. 1. 1. 27乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶酶學委員會縮寫酶學委員會縮寫表示第一大類表示第一大類,即氧化還原酶即氧化還原酶 表示第一亞類表示第一亞類,即被氧化基團為即被氧化基團為CHOH基基亞亞類的順序號亞亞類的順序號表示第一亞亞類表示第一亞亞類,氫受體為氫受體為NAD+酶的分類酶的分類 氧還酶氧還酶 AH2 + B A + BH2 轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶 AR + B A + BR 水解酶水解酶 AB + H2O AOH + BH 裂解酶裂解酶 AB A + B 異構酶異構酶 A B 合成酶合成酶 A + B + ATP AB + ADP + Pi氧還酶實例氧還

3、酶實例CH3CH2OHH3CCOHEthanolAcetaldehydeNAD+NADH + H+Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1)(oxidation with NAD+)轉(zhuǎn)移酶實例轉(zhuǎn)移酶實例OHOHOHHHOHHOHCH2OHHOHOHOHHHOHHOHCH2OPO32-HD-GlucoseD-Glucose-6-phosphateATPADP Hexokinase (EC 2.7.1.2)(phosphorylation)水解酶實例水解酶實例NCCONCCOO-RnHHRn-1HHNCCOO-H3NCCOO-RnHRn-1HH+ Carboxypepti

4、dase A (EC 3.4.17.1)(peptide bond cleavage)C-terminus of polypeptideH2O裂解酶實例裂解酶實例-OOCCCH3O+H+CO2+HCCH3OPyruvateAcetaldehydePyruvate decarboxylase (EC 4.1.1.1) (decarboxylation)異構酶實例異構酶實例HCOO-OOCHCOO-H-OOCHMaleateFumarate Maleate isomerase (EC 5.2.1.1)(cis-trans isomerization)合成酶實例合成酶實例-OOCCOCH3+CO2-

5、OOCCOCH2COO-PyruvateOxaloacetateATP ADP + PiPyruvate carboxylase (EC 6.4.1.1) (carboxylation)酶的化學本質(zhì)酶的化學本質(zhì)大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，少數(shù)酶是大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，少數(shù)酶是RNA酶是蛋白質(zhì)的證據(jù)：酶是蛋白質(zhì)的證據(jù)： 1）酶對熱不穩(wěn)定）酶對熱不穩(wěn)定 2）酶是兩性電解質(zhì)）酶是兩性電解質(zhì) 3）引起蛋白質(zhì)變性的因素能使酶失活）引起蛋白質(zhì)變性的因素能使酶失活 4）酶具有膠體的特性）酶具有膠體的特性 5）酶能被蛋白水解酶水解）酶能被蛋白水解酶水解 6）多次重結晶的酶其活性仍不變）多次重結晶的酶其活性仍不變 7）許多酶

6、的氨基酸序列測定）許多酶的氨基酸序列測定酶的輔因子酶的輔因子 酶按化學組成可分為單純酶和結合酶兩大酶按化學組成可分為單純酶和結合酶兩大類類 單純酶只由純的蛋白質(zhì)或單純酶只由純的蛋白質(zhì)或RNA構成構成, 如胃如胃蛋白酶等蛋白酶等 結合酶除蛋白質(zhì)組分外結合酶除蛋白質(zhì)組分外, 還含有對熱穩(wěn)定還含有對熱穩(wěn)定的非蛋白的小分子物質(zhì)的非蛋白的小分子物質(zhì), 前者稱為酶蛋白前者稱為酶蛋白, 后者稱為輔因子后者稱為輔因子; 如果小分子物質(zhì)與酶結如果小分子物質(zhì)與酶結合較松合較松, 則又稱為輔酶則又稱為輔酶, 反之反之, 則稱為輔基則稱為輔基 全酶全酶=酶蛋白酶蛋白+輔因子輔因子肌紅蛋白的三級結構肌紅蛋白的三級結構單

7、體酶單體酶 只有一條肽鏈的酶只有一條肽鏈的酶, 全部為水解酶全部為水解酶酶酶相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量(Mr)氨基酸殘基數(shù)氨基酸殘基數(shù)溶菌酶溶菌酶核糖核酸酶核糖核酸酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶羧肽酶羧肽酶A14,60013,70023,00023,80034,600129124203223307寡聚酶寡聚酶 由多個亞基組成的酶由多個亞基組成的酶, 亞基之間以非共價鍵結合亞基之間以非共價鍵結合, 已知的寡聚酶大多為糖代謝酶已知的寡聚酶大多為糖代謝酶酶酶亞基亞基相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量量(Mr)數(shù)目數(shù)目相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量(Mr)磷酸化酶磷酸化酶A肌酸激酶肌酸激酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶烯醇

8、化酶烯醇化酶424292,50040,00035,00041,000370,00080,000150,00082,000多酶復合物多酶復合物 幾個酶嵌合而成的復合物，一般由幾個酶嵌合而成的復合物，一般由26個個功能相關的酶組成功能相關的酶組成 相對分子質(zhì)量都在幾百萬以上相對分子質(zhì)量都在幾百萬以上 例如丙酮酸脫氫酶復合物和脂肪酸合成酶例如丙酮酸脫氫酶復合物和脂肪酸合成酶復合物復合物酶的結構與功能的關系酶的結構與功能的關系 活性部位和必需基團活性部位和必需基團 酶原的激活酶原的激活 同工酶同工酶活性部位和必需基團活性部位和必需基團 必需基團必需基團對這些基團對這些基團進行化學修飾進行化學修飾, 則

9、酶則酶的活性喪失的活性喪失, 常見的如常見的如Ser的羥基的羥基, His的咪的咪唑基唑基, Cys的巰基的巰基, Asp、Glu的側鏈羧基等的側鏈羧基等 活性部位活性部位酶分子中直接和底物結合，并酶分子中直接和底物結合，并與酶催化作用直接有關的部位。與酶催化作用直接有關的部位。羧肽酶羧肽酶A的活性部位的活性部位OHCH2CHOO-NHHNNH2NHArg 145COHNR1CHHHOTyr248OCR2HNHCOCHHNR3OHHNHNHis 69NHNHis 196OO-Glu 72OO-Glu 270Zn2+ENZYME酶原的激活酶原的激活 酶原酶原酶的無活性前體酶的無活性前體 酶原的激

10、活酶原的激活酶原在一定條件下轉(zhuǎn)變成活酶原在一定條件下轉(zhuǎn)變成活性酶的過程性酶的過程 胰蛋白酶：胰臟細胞分泌胰蛋白酶原，進胰蛋白酶：胰臟細胞分泌胰蛋白酶原，進入小腸要經(jīng)腸激酶激活后才有活性入小腸要經(jīng)腸激酶激活后才有活性 胃蛋白酶：由胃粘膜細胞分泌胃蛋白酶原，胃蛋白酶：由胃粘膜細胞分泌胃蛋白酶原，在胃液鹽酸作用下才有活性在胃液鹽酸作用下才有活性同工酶同工酶 具有不同分子形式但卻催化相同的化學反應具有不同分子形式但卻催化相同的化學反應 活性部位在結構上相同或相似活性部位在結構上相同或相似 乳酸脫氫酶的亞基分為乳酸脫氫酶的亞基分為M和和H兩種類型，可組兩種類型，可組裝成裝成H4、H3M、H2M2、HM3

11、、M4等等5種四聚體，種四聚體，都催化同一反應都催化同一反應CHOHCH3COO-+ NAD+CCH3COO-O+ NADH + H+酶作用的結構專一性酶作用的結構專一性(1)RCORO+ H2ORCOO- + ROH + H+酯酶OOHOROHOHCH2OH+ H2OOOHOHOHOHCH2OH+ ROH 葡萄糖苷酶ONH2H2N+H2O2 NH3+CO2脲酶只要求酯基，只要求酯基，R和和R可變可變要求要求-糖苷鍵，糖苷鍵，R可變可變只水解尿素，其它尿素衍生物一般不起作用只水解尿素，其它尿素衍生物一般不起作用酶作用的結構專一性酶作用的結構專一性(2)p5A3pA5pp5A3pA3pA2pA3

12、pA2pA2pA3pAp5A3p + A5pp5A3p + A3p + A2pA3p + A2pA2pA3p +AA + A5pp5A + A + A2pA + A2pA2pA +A2 p5AA + p5AA + 2 p5ARNase T2Alkaline Phosphatase Hydrolysis (APH)Phosphodiesterase I (PDI)PDIPDI酶作用的立體專一性（酶作用的立體專一性（1）L-乳酸乳酸D-乳酸乳酸乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶CCOO-HOHCH3CCOO-CH3O-2HCCOO-HOHCH3CCOO-CH3O-2H酶作用的立體專一性（酶作

13、用的立體專一性（2）OOHOOOHOAAPOOO-OOHOHAPOO-OOOHOHAHOOHD,D-A3pAL,L-A3pAD,D-A3pARNase T2D-A3p + D-AdenosineL,L-A3pARNase T2L-A3p + L-Adenosine酶的作用機制酶的作用機制 催化作用、過渡態(tài)、分子活化能催化作用、過渡態(tài)、分子活化能 中間產(chǎn)物學說中間產(chǎn)物學說 誘導契合模型誘導契合模型 使酶具有高度催化效率的因素使酶具有高度催化效率的因素催化作用、過渡態(tài)、分子活化能催化作用、過渡態(tài)、分子活化能過渡態(tài)模型過渡態(tài)模型中間產(chǎn)物學說中間產(chǎn)物學說SPE + SESE + P底物底物 產(chǎn)物產(chǎn)物誘

14、導契合模型誘導契合模型(1)誘導契合模型誘導契合模型(2)使酶具有高度催化效率的因素使酶具有高度催化效率的因素 鄰近定向效應鄰近定向效應-不僅指底物和酶活性部位不僅指底物和酶活性部位的鄰近，還包括正確的立體化學排列的鄰近，還包括正確的立體化學排列 “張力張力”和和“形變形變”-就是酶與底物誘導就是酶與底物誘導契合的過程契合的過程 酸堿催化酸堿催化-酶活性部位上某些基團可用作酶活性部位上某些基團可用作酸堿酸堿 共價催化共價催化-與底物形成不穩(wěn)定的共價中間與底物形成不穩(wěn)定的共價中間物物影響酶促反應速度的因素影響酶促反應速度的因素 pH對酶的影響對酶的影響 溫度對酶作用的影響溫度對酶作用的影響 激活

15、劑對酶作用的影響激活劑對酶作用的影響 酶動力學酶動力學-米氏方程式米氏方程式 抑制劑對酶作用的影響抑制劑對酶作用的影響 酶的別構效應酶的別構效應pH對酶的影響對酶的影響 每一種酶只能在一定范圍的每一種酶只能在一定范圍的pH內(nèi)才有活性，內(nèi)才有活性，超出這個范圍酶就失活，在某一超出這個范圍酶就失活，在某一特定特定pH可可能表現(xiàn)出最大的活性能表現(xiàn)出最大的活性 pH對酶的影響主要表現(xiàn)在兩方面：對酶的影響主要表現(xiàn)在兩方面：1）強）強酸或強堿本身使酶變性失活；酸或強堿本身使酶變性失活；2）pH改變改變影響酶活性部位上有關基團的解離，或影影響酶活性部位上有關基團的解離，或影響底物的解離響底物的解離 一般酶的

16、最適一般酶的最適pH在在4-8之間之間溫度對酶作用的影響溫度對酶作用的影響 在一定溫度范圍內(nèi)（在一定溫度范圍內(nèi)（040C），酶促反），酶促反應速度隨溫度升高而加快應速度隨溫度升高而加快 決大多數(shù)酶在決大多數(shù)酶在60C以上即失去活性以上即失去活性 各種酶在一各種酶在一定定條件下都有其一定的最適溫條件下都有其一定的最適溫度，度，例如例如動物體內(nèi)酶在動物體內(nèi)酶在3750C激活劑對酶作用的影響激活劑對酶作用的影響 能提高酶活力的物質(zhì)就是酶的激活劑能提高酶活力的物質(zhì)就是酶的激活劑 許多酶的激活劑就是一些金屬離子或其他許多酶的激活劑就是一些金屬離子或其他無機離子無機離子 以巰基為活性基團的酶，易被氧化降低

17、活以巰基為活性基團的酶，易被氧化降低活性，需加還原劑（如抗壞血酸等）性，需加還原劑（如抗壞血酸等）酶動力學酶動力學米氏方程式米氏方程式酶促反應速度酶促反應速度 S底物濃度底物濃度 Vmax最大酶促速度最大酶促速度Km米氏常數(shù)米氏常數(shù), Km = (k2 + k3)/k1Km S, = V/KmS, 一級反應一級反應S Km, = V, 零級反應零級反應E + SESE + Pk1k2k3 =Km + SVmax1 +KmS =Vmax Sor底物濃度對酶促反應速度作圖底物濃度對酶促反應速度作圖Vmax1 +KmS =某些酶的米氏常數(shù)某些酶的米氏常數(shù)酶酶底物底物Km (mol/L)過氧化氫酶過氧

18、化氫酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶麥芽糖酶麥芽糖酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶己糖激酶己糖激酶琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶尿素酶尿素酶-淀粉酶淀粉酶蔗糖酶蔗糖酶H2O2乳糖乳糖麥芽糖麥芽糖-酮戊二糖酮戊二糖葡萄糖葡萄糖果糖果糖琥珀酸鹽琥珀酸鹽丙酮酸丙酮酸尿素尿素淀粉淀粉蔗糖蔗糖2.5 x 10-24 x 10-32.1 x 10-12 x 10-31.5 x 10-41.5 x 10-35 x 10-73.5 x 10-52.5 x 10-26 x 10-42.8 x 10-2Lineweaver-Burk作圖法作圖法 1=KmVmaxS1Vmax1+Eadie-Hofstee Plot

19、KmSVV = Vmax 抑制劑對酶作用的影響抑制劑對酶作用的影響 不可逆抑制作用不可逆抑制作用抑制劑與酶的結合是一抑制劑與酶的結合是一不可逆反應不可逆反應 可逆抑制作用：可逆抑制作用：1）競爭性抑制）競爭性抑制抑制劑和抑制劑和底物競爭與酶結合；底物競爭與酶結合；2）非競爭性抑制）非競爭性抑制抑抑制劑和底物同時結合在酶的不同部位上制劑和底物同時結合在酶的不同部位上不可逆抑制作用不可逆抑制作用OHEnzymeactive siteserinePOOOFDFP+POOOO-HF可逆抑制可逆抑制-競爭性抑制競爭性抑制E + SESE + Pk1k2k3 =Vmax SKm + SKm = Km1 +

20、IKi1=KmVmaxS1Vmax1+VV+IEI特點：特點：改變改變Km不改變不改變max，當?shù)孜餄舛群芨邥r，當?shù)孜餄舛群芨邥r，抑制作用可以被解除抑制作用可以被解除競爭性抑制競爭性抑制Lineweaver-Burk圖圖Km = Km1 +IKi1=KmVmaxS1Vmax1+V可逆抑制可逆抑制-非競爭性抑制動力學方程非競爭性抑制動力學方程E + SESE + Pk1k2k3 =Vmax SKm + SVmax = Vmax1 +IKi1=KmVmaxS1Vmax1+VV+IEI + S+IESI特點：影響特點：影響max而不改變而不改變m，不能用增大，不能用增大的辦法克服。的辦法克服?？赡嬉?/p>

21、制可逆抑制-非競爭性抑制動力學圖非競爭性抑制動力學圖Vmax = Vmax1 +IKi1=KmVmaxS1Vmax1+V酶活力酶活力 是指酶催化指定化學反應的能力，其大小是指酶催化指定化學反應的能力，其大小可用在一定條件下酶促反應的速率來表示，可用在一定條件下酶促反應的速率來表示， 反應速率愈快，就表明酶活力愈高，通常反應速率愈快，就表明酶活力愈高，通常是測定單位時間產(chǎn)物的增加量來確定是測定單位時間產(chǎn)物的增加量來確定 國際酶活力單位（國際酶活力單位（IU，1 IU = 1 mol/min ）：在最適條件下，每分鐘內(nèi)催）：在最適條件下，每分鐘內(nèi)催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量化一微摩爾底物轉(zhuǎn)

22、化為產(chǎn)物所需的酶量 酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。力單位數(shù)。測定酶活力測定酶活力 常用分光光度法，利用底物、產(chǎn)物或指示劑常用分光光度法，利用底物、產(chǎn)物或指示劑在紫外光或可見光部分吸光度的不同，選擇在紫外光或可見光部分吸光度的不同，選擇一個適當?shù)牟ㄩL，連續(xù)地測出反應過程中反一個適當?shù)牟ㄩL，連續(xù)地測出反應過程中反應體系吸光度的變化，再進一步推算底物或應體系吸光度的變化，再進一步推算底物或產(chǎn)物濃度或數(shù)量的變化，從而求出酶活力產(chǎn)物濃度或數(shù)量的變化，從而求出酶活力酶的分離純化酶的分離純化 原材料處理與蛋白提?。杭磸膭游?、植物、微原材料處理與蛋白提?。杭?/p>

23、從動物、植物、微生物等組織或細胞中提取含有目標酶的原液生物等組織或細胞中提取含有目標酶的原液 粗制分離：用鹽析法、等電點沉淀法或有機溶粗制分離：用鹽析法、等電點沉淀法或有機溶劑分離法等除去含量比較多的雜質(zhì)，并濃縮酶劑分離法等除去含量比較多的雜質(zhì)，并濃縮酶溶液溶液 精制分離：用柱層析法、梯度離心法或者電泳精制分離：用柱層析法、梯度離心法或者電泳法進一步純化法進一步純化 酶制劑的脫鹽、濃縮、干燥和保存：用透析法酶制劑的脫鹽、濃縮、干燥和保存：用透析法脫鹽，濃度較低時，需進一步濃縮或者通過冷脫鹽，濃度較低時，需進一步濃縮或者通過冷凍真空干燥做成固體制劑進保存凍真空干燥做成固體制劑進保存酶的分離純化應注意事項酶的分離純化應注意事項 在酶的分離純化過程中始終保持低溫（通常在酶的分離純化過程中始終保持低溫（通常4 C左右），透析、層析或電泳等操作需在專門的冷室左右），透析、層析或電泳等操作需在專門的冷室進行進行 將酶在低溫下保存，一般可在將酶在低溫下保存，一般可在-20 C至至-80 C之之間保存酶制劑間保存酶制劑 使用溫和的操作條件，在純化過程中使用