聚合酶鏈反應(yīng)張

1、2021/3/261一.概 述 聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction,PCR),又稱無細(xì)胞克隆技術(shù),是一種特定DNA片段在體外快速擴(kuò)增的新方法。 數(shù)小時(shí)達(dá)107-108倍 1985年,Centus公司Kary Mullis 發(fā)明 1993年因此獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)2021/3/262PCR擴(kuò)增儀2021/3/263變性53533535引物復(fù)性35355335P1P22021/3/264延伸35355335P1P2再變性2021/3/265再?gòu)?fù)性P1P1P2P2再延伸2021/3/266P1P1P2P2短片段以指數(shù)形式擴(kuò)增短片段以指數(shù)形式擴(kuò)增長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增長(zhǎng)片段以線

2、性形式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在P1-P2之間之間2021/3/267PCR循環(huán)的主要參數(shù)循環(huán)的主要參數(shù):1. 預(yù)變性預(yù)變性:92C-95 C, 2-5min2. 變性：變性： 92C-95 C,30s-1min3. 復(fù)性：復(fù)性： 40 C-60 C，20s-2min4. 延伸：延伸： 70 C-75 C，30s-3min5. 總延伸：總延伸：72 C， 7min2021/3/268三、三、PCRPCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C2021/3/269PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增條件 94, 5min 94, 1min 30 55, 1min

3、 72, 1min 72, 7min 2021/3/26102021/3/2611DNA Marker NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2021/3/26122021/3/26132021/3/26142021/3/2615三. PCR反應(yīng)體系 緩沖液提供所需的pH環(huán)境 DNA模板:欲擴(kuò)增的DNA樣品 dNTP: 四種脫氧核苷酸 MgCl2： 提供Mg+離子 引物： 根據(jù)欲擴(kuò)增的DNA樣品設(shè)計(jì) 耐熱的DNA聚合酶： 來源于喜熱的細(xì)菌2021/3/2616耐熱的DNA聚合酶 Taq聚合酶喜溫性細(xì)菌Thermus aquaticus BM53聚合活性53外切活

4、性 Pwo聚合酶 喜溫性細(xì)菌Pyrococcys woesei53聚合活性35外切活性（校正）耐熱 1000C 2小時(shí) Tth聚合酶 喜溫性細(xì)菌Thermus thermophilus53聚合活性當(dāng)錳離子存在時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性 C.therm聚合酶 喜溫性細(xì)菌Thermus thermophilus35外切活性（校正）當(dāng)鎂離子存在時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性2021/3/26171.PCR buffer: 72C 時(shí),反應(yīng)體系的pH值下降1個(gè)單位,接近于7.2 MgCl2 濃度12mmol/L，過量引起非特異擴(kuò)增，不足使酶活性顯著降低，導(dǎo)致產(chǎn)物量少;2. 三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）: 是合成的原料，四

5、種的濃度應(yīng)相等，濃度一般為50200molL。2021/3/26183.引物: 0.1-1umol/L 高濃度 引物二聚體、非特異產(chǎn)物 低濃度 產(chǎn)率低4. Taq酶: 來自于水生棲熱菌（Thermus aquaticus), 最適反應(yīng)溫度為7075oC。 常用濃度為12.5U/100ul,濃度過高缺乏專一性,過低則產(chǎn)物產(chǎn)量低。2021/3/26195. DNA樣品 按照常用的分子生物學(xué)方法制備的DAN或RNA樣品,其純度應(yīng)能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 質(zhì)量100-500ng 不含有蛋白酶、核酸酶、DNA結(jié)合酶、 Taq酶抑制劑6 .石蠟油 減少反應(yīng)液的蒸發(fā)2021/3/2620四.影響PCR的主要因素1

6、. 溫度參數(shù): 模板變性溫度-低溫不產(chǎn)生單鏈DNA模板,PCR不啟動(dòng);超過95C,影響Taq酶活性 退火溫度 溫度高-特異性強(qiáng)，引物與模板結(jié)合不 牢，DNA擴(kuò)增效率下降 溫度低-產(chǎn)量高，特異性差 Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5 2021/3/2621 引物延伸溫度: 取決于Taq酶最適溫度 70-75C大于1Kb的DNA片段,1min以上,并加入明膠或BSA 15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段擴(kuò)增2021/3/2622PCR擴(kuò)增平臺(tái)期 循環(huán)到一定次數(shù)后,擴(kuò)增產(chǎn)物不再以指數(shù)關(guān)系增加,而是以線性關(guān)系增加或不增加，稱為平臺(tái)期。 提前進(jìn)入平臺(tái)期的原因 1.引物量不足 2.dNT

7、P量不足 3.Taq酶失活 4.原始模板數(shù)量太多2021/3/2623 循環(huán)次數(shù): 25-35次 次數(shù)太多-核苷酸錯(cuò)配、非特異擴(kuò)增多 進(jìn)入平臺(tái)期,增加次數(shù)效果不大 次數(shù)太少-產(chǎn)率低2021/3/26242.引物設(shè)計(jì) 引物 與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷 酸片段。 5引物又稱上游引物,其核苷酸序列與模板 5序列相同。 3引物又稱下游引物,其核苷酸序列與模板 3序列互補(bǔ)。2021/3/2625引物長(zhǎng)度 人類基因組有30億bp,按照統(tǒng)計(jì)學(xué)的計(jì)算,隨機(jī)組合的17 個(gè)堿基的核苷酸序列，在人類基因組中可能出現(xiàn)一次。 引物長(zhǎng)度一般為20-24個(gè)堿基。有時(shí)也見50甚至更多的堿基。2021/3/2626 引物

8、組成:堿基隨機(jī)分布,避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在,G、C含量一般在40-60%引物內(nèi)部避免形成次級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)兩個(gè)引物之間不應(yīng)互補(bǔ)，避免形成引物 二聚體2021/3/2627兩條引物應(yīng)避免有同源序列,以免兩條引物競(jìng)爭(zhēng)模板的同一位點(diǎn)。引物5端: 可加上酶切位點(diǎn)或熒光素等引物3端:5-6個(gè)堿基與靶DNA嚴(yán)格配對(duì)2021/3/26283 TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATA CGGTAAG5 引物 5 GTGAATTCTCTC AACCGTAT 3注:紅色部分為限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn),堿基與 模版鏈不完全互補(bǔ)。2021/3/2629逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcrip

9、tion PCR,RT-PCR） 原理原理: :提取組織細(xì)胞總提取組織細(xì)胞總RNA,RNA,以其中的以其中的mRNAmRNA為模板，為模板，采用采用需要的需要的引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成錄成cDNAcDNA。再以再以cDNAcDNA作為模板，通過特異性作為模板，通過特異性引物，引物，PCRPCR擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增目的基因。應(yīng)用應(yīng)用: :分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物; ;獲取目的基因獲取目的基因; ; 合成合成cDNAcDNA探針；探針；2021/3/2630選取適當(dāng)?shù)慕M織,提取總RNA以mRNA做模版加入引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、合成cDNA的第一鏈逆

10、轉(zhuǎn)錄酶水解mRNA鏈合成cDNA的第二鏈加入引物、Taq酶,做常規(guī)PCR 擴(kuò)增出大量的cDNA分子2021/3/2631RT-PCR操作需注意的問題: 1.模版RNA應(yīng)嚴(yán)格純化,; 2.避免RNA酶污染; 3.所用與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的物品,需用0.1的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡處理。2021/3/2632增效PCR（booster PCR） 當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題:一是形成引物二聚體,一是非特異擴(kuò)增,而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少

11、產(chǎn)物亦少。約經(jīng)1520個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。2021/3/26332. 2. 巢式巢式PCRPCR（nest PCRnest PCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR,與上面不同的是,第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。2021/3/2634巢巢式式PCR采用兩對(duì)引物進(jìn)行采用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR,其中第二對(duì)引物位于其中第二對(duì)引物位于第一對(duì)引物內(nèi)第一對(duì)引物內(nèi)。P1上P1下P2上P2下P1上上P2上上2021/3/2635First roundprimersFirst roundPCRSecond roundprimersSecond roundPCRGene of interest2021/3/2636 在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物,如果這些引物的退火溫度相近,并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。 多重PCR常用來檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或在檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。2021/