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文檔簡介
1、常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介目 錄全長cDNA克隆引物設(shè)計(jì)染色體步移技術(shù)全長cDNA克隆 是許多后續(xù)更深入實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ); 真核生物mRNA的特征及轉(zhuǎn)錄過程的了解; 全長cDNA克隆方法:靈活掌握; 同源克隆技術(shù) RACE-PCR技術(shù)基因克隆前的準(zhǔn)備工作 看有沒有被別人克隆出來; 查看文獻(xiàn)了解基因的功能及表達(dá)特征; 了解該基因可能涉及的工作(如激酶活性的測定及DNA-蛋白相互作用等),制定計(jì)劃; 了解相近物種該基因的信息,以利于擴(kuò)增過程中預(yù)測PCR的延伸時間;同源片段的克隆 本實(shí)驗(yàn)室的EST數(shù)據(jù)庫; NCBI數(shù)據(jù)庫; RT-PCR用兼并引物擴(kuò)增同源片段;設(shè)計(jì)兼并引物是重點(diǎn)!注意事項(xiàng): 高質(zhì)量的mRNA和高效率
2、的逆轉(zhuǎn)錄; 加大引物濃度; 選擇mRNA表達(dá)量高的組織做模板; 梯度PCR或者降落PCR; 巢氏PCR; 序列分析;3RACE: 原理:5RACE 原理:注意事項(xiàng): RNA的完整性; 高效的逆轉(zhuǎn)錄酶; 多次5RACE相結(jié)合; 應(yīng)用豐度高的組織做模板; 長片段擴(kuò)增應(yīng)用LA-Taq酶; 同源克隆方法; 用隨機(jī)引物或者OligoT引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄;序列分析 引物設(shè)計(jì):Primer 5.0; 一般的序列處理:DNAStar中的Editseq; 序列拼接: DNAStar中的Seqman、BL2; 序列在線比對:NCBI-BLAST ( / ); 序列多
3、重比對:Bioedit、ClustalW2 (http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/); 尋找ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html ); 序列作圖:Bioedit、EMBOSS ( http:/emboss.bioinformatics.nl/ ); 構(gòu)建進(jìn)化樹:MEGA 4.1; 蛋白結(jié)構(gòu)域分析:SMART( http:/smart.embl-heidelberg.de/ ); 蛋白理化性質(zhì)分析及二、三級結(jié)構(gòu)分析:EXPASY( http:/www.ex
4、pasy.ch/tools/ )、Psipred ( http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ ); 信號肽分析:SignalP( http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ); 磷酸化位點(diǎn)分析:NetPhos 2.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ ); 糖基化位點(diǎn):NetNGlyc 1.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ );引物設(shè)計(jì) 兼并引物 RACE引物 熒光定量引物 染色體步移引物 原核表達(dá)用
5、引物 PCR-SSCP引物總原則 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。 兼并引物 兼并堿基: M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T 簡并度:兼并引物設(shè)計(jì)步驟 利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸
6、序列 對所找到的序列進(jìn)行多序列比對 確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計(jì)兼并引物(軟件或者人工) 選擇合適的序列進(jìn)行多重比對; 選擇高度保守的序列作為引物; 人工設(shè)計(jì)時要注意引物序列是和原序列相同還是反向互補(bǔ)的; 簡并度不能太高,可用次黃嘌呤代替N; 引物的3端殘基盡可能使用確定殘基 ; 降落PCR; 巢氏PCR;RACE引物 各3條重疊的引物,引物之間最好距離100-200bp; 若同源片段長度太短,可先做3RACE,再做5RACE; 盡量靠近c(diǎn)DNA末端(3RACE-3末端; 5RACE-5末端);熒光定量引物 純化方式:PAGE; 產(chǎn)物長度:80-150bp; TM值:58-62; 在編碼區(qū)內(nèi)靠近3
7、末端處設(shè)計(jì); 高的特異性:測序及熔解曲線分析;染色體步移引物 以DNA為模板設(shè)計(jì)引物; 3條重疊引物; 高的退火溫度:高于60度;原核表達(dá)用引物 會讀表達(dá)載體圖譜; 去除信號肽序列; 根據(jù)目的表達(dá)序列直接取相應(yīng)序列作為引物,注意要不要加終止密碼子; 在引物的5末端加酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基,注意方向; 選酶切位點(diǎn):選擇常用的內(nèi)切酶,并看這兩種酶是否可以在統(tǒng)一體系中進(jìn)行雙酶切;PCR-SSCP引物 PCR產(chǎn)物長度:150-400bp; 高的特異性;染色體步移克隆啟動子Tail-PCR預(yù)測啟動子位置將啟動子序列克隆進(jìn)一個無其他啟動子,且報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛傅妮d體中轉(zhuǎn)染細(xì)胞系熒光素酶活性的測定確定啟動子活性的強(qiáng)弱 謝 謝!同源片段的克隆 本實(shí)驗(yàn)室的EST數(shù)據(jù)庫; NCBI數(shù)據(jù)庫; RT-PCR用兼并引物擴(kuò)增同源片段;設(shè)計(jì)兼并引物是重點(diǎn)!同源片段的克隆 本實(shí)驗(yàn)室的EST數(shù)據(jù)庫; NCBI數(shù)據(jù)庫; RT-PCR用兼并引物擴(kuò)增同源片段;設(shè)計(jì)兼并引物是重點(diǎn)!注意事項(xiàng): RNA的完整性; 高效的逆轉(zhuǎn)錄酶; 多次5RACE相結(jié)合; 應(yīng)用豐度高的組織做模板; 長片段擴(kuò)增應(yīng)用LA-Taq酶; 同源克隆方法; 用隨機(jī)引物或
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