免疫原的制備

1、用為免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的抗原物質(zhì)如果是人工 合成的。質(zhì)地比較純，免疫動(dòng)物后可獲得質(zhì)量好 的抗血清。如果以從組織中提取的物質(zhì)作為抗 原，必須經(jīng)過純化，保證提取物的純凈，才能獲 得質(zhì)量好的抗血清。某些物質(zhì)的分子量比較小， 抗原性弱，屬于半抗原，不易使動(dòng)物產(chǎn)生抗體， 必須把這些半抗原連接到大分子物質(zhì)（載體）上, 形成較為理想的免疫原，既能減少免疫注射的次 數(shù)，又可節(jié)約抗原，產(chǎn)生良好的免疫效應(yīng)，獲得 高質(zhì)量的抗體。（一）載體用為作為載體的物質(zhì)較多，下列幾類可供選擇。蛋白質(zhì)類載體：人血清白蛋白（HSA、牛血清白蛋白（BSA、 兔血清白蛋白（RSA、牛甲狀腺球蛋白（TG、血藍(lán)蛋白（Hemocyanin） 以

2、及人、牛和雞丫-球蛋白等均可作為載體。這些載體免疫活性較強(qiáng)， 有商品供應(yīng)，容易獲得，即使自選提取，操作也較方便。常用 的有 TG BSA HA濤，以TG為好。多肽聚合物，人工合成的多聚賴氨酸 、多聚谷氨酸、多聚混合 氨基酸等，可與半抗原結(jié)合，所形成的免疫原可獲高滴度、高親合度 的抗血清。大分子有機(jī)化合物和某些粉末，如聚乙烯毗咯酮、竣甲基纖維素、 聚甲基丙酸酯微粒、乳膠和炭末等，可吸附半抗原，也可用來作為載 體，但用這類載體合成的免疫原免疫動(dòng)物，所獲抗血清的質(zhì)量不穩(wěn)定。載體，尤其是大分子物質(zhì)本身就是一種抗原，它們進(jìn)行體內(nèi)，可 發(fā)揮致敏作用，激活免疫系統(tǒng)，從而使半抗原也可以使機(jī)體產(chǎn)生優(yōu)質(zhì) 的抗體。

3、因此，如果把半抗原與無免疫原性的載體結(jié)合，就不能使機(jī) 體產(chǎn)生抗體。另外，半抗原與載體結(jié)合后，可適當(dāng)延遲其降解和排出 體外，從而可以發(fā)揮更久的作用。（二）偶聯(lián)劑半抗原和載體聯(lián)接，操作比較簡單，在一般實(shí)驗(yàn)室中都可進(jìn)行。 但對(duì)反應(yīng)條件有一定的要求：在反應(yīng)過程中半抗原的免疫活性不發(fā)生 改變，也不應(yīng)引起載體變性到不溶解的程度。 常用的方法是利用偶聯(lián) 劑把半抗原和載體聯(lián)接起來。用作偶聯(lián)劑的有碳化二亞胺類、戊二醛、 二異富酸化合物和二鹵化二硝基苯等。這些偶聯(lián)劑使半抗原與載體在 -COOH -NH2或-SH等基團(tuán)部位發(fā)生結(jié)合。碳化二亞胺偶聯(lián)過程示意如下：由反應(yīng)過程可見，碳化二亞胺的偶聯(lián)作用即可以在NH2部位發(fā)

4、生，也可發(fā)生在竣基部位。戊二醛所起的偶合作用與碳化二亞胺有所不同，戊二醛的兩個(gè)醛 基分別與載體和半抗原的-NH2結(jié)合。它起一種“橋梁”作用，而把 載體與半抗原聯(lián)接在一起，其反應(yīng)過程為：在免疫原的制備中，應(yīng)根據(jù)不同的半抗原選用偶聯(lián)劑。(三)制備過程以制備催產(chǎn)素(OT)免疫原為例：(1) ImgOT溶解于1ml雙蒸儲(chǔ)水或0.25%醋酸溶?夜中。10mgTG 溶解于1ml 0.1mol/LPBS(pH7.5)或蒸儲(chǔ)水內(nèi)。(2)把OT溶液與TG溶液振蕩混勻。(3)邊攪拌邊滴加入0.25%戊二醛1ml。加畢后再攪拌510min, 在室溫下繼續(xù)反應(yīng)23h,就可供免疫動(dòng)物用。免疫原以新制備的為好，如果一次制

5、備了較多的免疫原，也可保 存在-40 C的低溫冰箱內(nèi)備用?？乖闹苽涑暾募?xì)胞可作為抗原外，各種不同的細(xì)胞內(nèi)存在的各種分子 量不同的物質(zhì)，也都具有全抗原或半抗原的性質(zhì)，某種抗原物質(zhì)可能 是某一類細(xì)胞所特有的，可作為這種細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志。由于細(xì)胞存在 著許多性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，有時(shí)要從這眾多的物質(zhì)中提取、純化某 種抗原物質(zhì)，以供科學(xué)研究之用。、抗原的提取抗原的制備是一件十分細(xì)致的工作，要制備一個(gè)高純度的抗原， 需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng) 域的知識(shí)。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來的分離、純化方法的主要原 理不外乎科二個(gè)方面：利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別將他們 分配

6、到可用機(jī)械方法分離的兩或幾個(gè)物相中， 如鹽析、有機(jī)溶劑抽提、 層析和結(jié)晶等；把混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使 各組分分配于不同的區(qū)域而達(dá)到分離的目的， 如電泳、超速離心和超 濾等。由于組織細(xì)胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物 質(zhì)，其分離方法也不一樣，就是同一類大分子物質(zhì)，因選材不同，所 使用的方法也很大差別。因此很難有一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)方法供提取任何 生物活性物質(zhì)使用，所以在提取前必須針對(duì)所欲提取的物質(zhì)， 充分查 閱文獻(xiàn)資料，選用合適的方法。如果要提取一個(gè)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗 原物質(zhì)，更需要經(jīng)過各種方法的比較探索， 才能找到一些工作規(guī)律和 獲得預(yù)期的效果?？乖镔|(zhì)的制備，大概要經(jīng)

7、過如下過程：材料的選擇和預(yù)處理； 細(xì)胞的粉碎（細(xì)胞器的分離）。提??；純化；濃縮或干燥， 保存?，F(xiàn)分別簡述如下。（一）材料的選擇及預(yù)處理選擇什么材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。通常選含量高、工藝簡便、 成本低的材料。材料選定后，通常要進(jìn)行預(yù)處理，剔除結(jié)締組織、脂 肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進(jìn)行提取，則應(yīng)冷凍保存， 動(dòng)物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材 料。(二)細(xì)胞的粉碎除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)、酶不需粉碎細(xì)胞外， 凡要提取組織內(nèi)、細(xì)胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)， 都必須把組織和 細(xì)胞粉碎，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi)。不同的組織，細(xì)胞的破碎 難易不一，因

8、此所使用的粉碎方法也不完全相同。如腦、胰、肝等比 較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再 作勻漿。現(xiàn)漿常用的細(xì)胞粉碎方法介紹如后。1 .物理法(1)高速組織搗碎機(jī)：通常由調(diào)速器、支架、馬達(dá)、帶桿刀葉、 有機(jī)玻璃筒等組成。把材料放于筒內(nèi)(約占筒內(nèi)容積的1/3)固定筒蓋，開動(dòng)馬達(dá)，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內(nèi)臟組織。(2)玻璃勻漿器：由一個(gè)內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀(球面經(jīng)過磨砂)玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適 量溶液，插入研桿，用手或電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)研桿，并上下移動(dòng)。用此法細(xì)胞 破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，對(duì)大分子的破壞也少。是粉碎少量軟 嫩材料(腦

9、、胰、肝等)時(shí)常用的方法。(3)超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同 頻率，處理1015min,超聲波處理時(shí)溶液溫度升高，使不耐熱的物 質(zhì)失活，使用時(shí)為防止溫度升高，除間歇開機(jī)外，還需人工降溫，避 免溶液內(nèi)存在氣泡。核酸及某些酶對(duì)超聲波很敏感，要慎用。(4)反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到零下 1520。C,凍固后 取出，緩慢解凍，如此反復(fù)操作，可使大部分動(dòng)物性細(xì)胞及胞內(nèi)的顆 粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。(5)冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持?jǐn)?shù)分鐘后取 出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細(xì)胞破碎?？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。2 .化學(xué)和生物化學(xué)法(1)自溶法：把新鮮材料置于一定的p

10、H和適宜的溫度下，利用 組織細(xì)胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞， 使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來。動(dòng)物材 料的自溶溫度選在04C,需加少量防腐劑，自溶時(shí)間較長，不易控制，不常用(2)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細(xì)胞壁。在每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的懸液中加100wg至1mg溶菌酶，37C,保 溫10min,細(xì)胞就破壞了。止匕外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細(xì) 菌細(xì)胞之用。(3)表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十 二烷基毗咤、去氧膽酸鈉等。(三)抗原的提取提取、抽提、萃取這3個(gè)詞的含義基本相同。但一般說來，提取 是指在分離純化前期，將經(jīng)過處理或粉碎了的細(xì)胞置于一定條件和溶 劑中，讓被提取物充

11、分地釋放出來的過程， 而抽提則是貫穿于分離純 化的整個(gè)過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復(fù)提取蛋白液，用 苯酚反復(fù)抽提分離DN用口 RNA影響提取的因素主要來自被提取物在 提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴(kuò)散到液相的難易。一個(gè)物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的 理化性質(zhì)有關(guān)。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易 溶于非極性大分子的等電點(diǎn)遠(yuǎn)的 pH值使溶解度增加。因此，在不同 的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。 要達(dá)到分離提純的目 的，必須靈活地應(yīng)用這些因素?，F(xiàn)將蛋白質(zhì)、核酸、多肽等抗原

12、(半抗原)的提取方法概要敘述 于下。1 .蛋白質(zhì)和酶的提取 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸連接而成的高 分子物質(zhì)，分子量從數(shù)千至百萬。數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)，按它們的功能 可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受體蛋白、運(yùn) 動(dòng)蛋白、運(yùn)輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如 膠原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的差異，它們?nèi)芙舛?也各不相同。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少 數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于有機(jī)溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對(duì)選 擇撮蛋白質(zhì)的溶劑具有重要意義。(1)水溶液提?。河捎诘鞍踪|(zhì)大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液， 因此提取蛋白質(zhì)以水溶液為主，其中尤以稀鹽液和

13、緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn) 定性好，溶解度大，氫是最常用的溶劑。應(yīng)注意下列幾點(diǎn)：鹽濃度， 常用等滲溶液，尤以0.020.05mol/L磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖 液、0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用較多。如酵母脫氫酶以 0.66mol/L磷 酸氫二鈉溶液提取，6-磷酸葡萄糖脫氫酶以0.1mol/L碳酸氫鈉液提 取，脫氧核糖核蛋白在低鹽溶液中溶解度小，就要用 1mol/L以上的 氯化鈉液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低鹽溶液提取效果更好。 pH值的選擇對(duì)蛋白質(zhì)提取頗為重要，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解度和穩(wěn)定 性與pH值關(guān)系很大。提取液的pH值首先要保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范疇 內(nèi)，通常在等電點(diǎn)的兩側(cè)，堿性蛋白如細(xì)胞色素C和

14、溶菌酶選在偏酸 一側(cè)，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶應(yīng)選在偏堿一側(cè)。溫度：為防止活性蛋白變性、降解而失活，溫度通常選在5c以下。對(duì)少數(shù)耐溫的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利 于提純，如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許多多肽激素可選擇3750c條件下提取，效果比低溫提取更好。（2）有機(jī)溶劑提?。阂恍┎蝗苡谒⑾←}、稀酸或稀堿溶液的 蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機(jī)溶劑來提取。如用70%-80濃醇提取款蛋白；用60%-70%勺酸性乙醇提取胰島素，既可抑制水解酶 對(duì)胰島素的破壞，又可除去大量雜蛋白，用丁醇提取某些附于微粒體 和線粒體的酶，一些與脂質(zhì)結(jié)合牢固的蛋白質(zhì)和酶以丁醇提取，效

15、果較好。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脫氫酶和堿性磷 酸脂酶。丁醇提取法對(duì)pH及溫度的選擇范圍較廣（Ph310）,溫度 由零下2c40c均可。2 .核酸的提取核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA ,另一類為脫氧核糖核酸（DND。核酸的分子量極大，人數(shù)萬致億萬。 核酸是兩性化合物，在一定的等電點(diǎn)。溶于水，其水溶液呈酸性，不 溶于乙醇等有機(jī)溶劑。細(xì)胞內(nèi)的核酸常和蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質(zhì)溶液中的溶解度有顯 著區(qū)別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中， 脫氧核糖核蛋白的溶解度 隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當(dāng)氯化鈉濃度為0.14mol/L時(shí)，其 溶解度僅為

16、水中溶解度的1/100，但當(dāng)氯化鈉濃度再增加時(shí)，脫氧核 糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到 0.5mol/L時(shí)，其溶 解度與水中溶解度相似，當(dāng)氯化鈉濃度增加到 1mol/L時(shí)，它的溶解 度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當(dāng) 大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提 取脫氧核糖核蛋白時(shí)，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的 溶解度與溶液的pH也有關(guān)。當(dāng)pH為4.2時(shí)，脫氧糖核蛋白的溶解度 最低，而pH為2.02.5時(shí)，核糖核蛋白的溶解度最低。所以調(diào)節(jié)氯 化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開 來。（

17、1） RNA勺提取：RNA&細(xì)胞中主要有三種類型，即rRNA （核 微粒核糖核酸）、tRNA （轉(zhuǎn)移核糖核酸）和mRNA信使核糖核酸）。 mRN求謝極不穩(wěn)定，提取時(shí)要求條件較嚴(yán)格；tRNA當(dāng)細(xì)胞破碎后， 用酸處理得到“ pH5沉淀，即可從中分離tRNA; rRNA占全部RNA勺 80姒上，比較穩(wěn)定，一般提取的大分子RNAi要為此部分。核內(nèi)rRNA 常先將細(xì)胞核分離后，再進(jìn)行提取，可避免其他細(xì)胞組分RNA勺干擾。RNA勺提取，通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反 復(fù)提取細(xì)胞質(zhì)中的核糖核蛋白，而留下含有DNA勺細(xì)胞核物質(zhì)，然后 用10%昔酸調(diào)至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用

18、0.5mol/L氯化 鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于 0.5mol/L碳酸氫 鈉溶液中，離心，取上清液，調(diào) pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉 溶液洗滌，再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質(zhì)可用 含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙 醇，RNAIP以鈉鹽形式沉淀出來。提取RN隅一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核 蛋白，而一步將RNA勺蛋白質(zhì)分開，并同時(shí)把RN餌由提出來，此類方 法是在破碎細(xì)胞做成勻漿時(shí)，加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺 酸鈉；而現(xiàn)在最常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質(zhì)沉淀于酚層

19、中，水層中含RN府口多糖，然后用乙醇使RNA冗 淀，四種物質(zhì)一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其應(yīng)用舉例如下：肝臟rRNA的提取：按肝重（鮮）加入10倍容積苯酚-甲酚混合 液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸儲(chǔ)水中，另加入0.5g 8-羥 基唾咻配成）及10倍容積的0.5%蔡-1 , 5-二磺酸水溶液（g/V）做 勻漿后在20c攪拌20min。肝臟細(xì)胞核內(nèi)mRNA勺提?。合确蛛x細(xì)胞核，再將核懸浮于 3倍 容積的0.5%pH6.5的蔡二磺酸水溶液（g/V）中勻漿后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（內(nèi)含0.1%8-羥基唾咻）在2c振蕩提取30min。酵母tRNA的提?。?00g酵母（濕重）加入200ml水，300ml 90% 苯酚水溶液，振蕩2h,4 c冰箱中過液，使之提取完全。以上介紹了用冷酚法提取各種 RNA勺一些實(shí)例，近來還有皂土酚 法（即除苯酚外還加入皂土吸附蛋白質(zhì)）提取 RNA據(jù)報(bào)道比普通酚 法提取RN