唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定_

1、.唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬?1 通過唾液淀粉酶性質(zhì)的測定，了解酶的專一性和多種因素對酶粗反應(yīng)的影響， pH，底物濃度，溫度，激活劑，抑制劑等2學(xué)習(xí)酶活力，酶活力單位，比活力的測定， 加深對概念的理解；3學(xué)會用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量，學(xué)會用3,5-二硝基水楊酸測定還原糖的含量，熟練操作分光光度計(jì)。二實(shí)驗(yàn)試劑和器材器材：可見光分光光度計(jì)，試管，移液管，恒溫水浴鍋，pH 試紙， 1000ml 容量瓶和 100ml 的容量瓶各一只；藥品：可溶性淀粉，考馬斯亮藍(lán)試劑G-250，3,5-二硝基水楊酸，NaoH,HCL ，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，醋酸，醋酸鈉，蒸餾水，95%乙醇， 85

2、%磷,；0.15molNaCL/ml ，0.15mol/L 硫酸銅溶液 ， 碘化鉀碘溶液：將碘化鉀 20 克和碘 10 克溶解在 100ml 水中，使用前稀釋10 倍。注：（1）考馬斯亮藍(lán) G-250 試劑：考馬斯亮藍(lán)試劑 G-250100mg 溶于 95%乙醇中，加入 100ml85%磷酸，加水稀釋至 1000ml，過濾即可。（ 2）標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：結(jié)晶牛血清白蛋白用凱式定氮法測蛋白含量，根據(jù)其純度用 0.15mol/L Nacl 配置成 0.1mg/L 的蛋白液；（ 3）配置 0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml的的溶性淀

3、粉溶液 ;1 / 5.(4)配置一系列 pH2 的緩沖溶液0.2Mol/L 磷酸氫二鈉溶液為28.40g/L,Mr=141.98,稱取 2.84g 溶于 100ml 的水中0.1Mol/L 檸檬酸溶液 21.01g/l,Mr=210.14,稱取 2.1 溶于 100ml 水中；錐形瓶0.2Mol/L 磷酸氫二鈉0.1Mol/L 檸檬酸緩沖液 pH號（毫升）（毫升）10.419.602.224.1115.893.037.7112.294.0410.309.705.0511.158.855.4612.097.915.8713.226.786.2814.555.456.6916.473.537.01

4、018.171.837.41119.150.857.81219.450.558.05 配置 0.15mol/L 的 NaCL 溶液和 0.15mol/L 硫酸銅溶液三實(shí)驗(yàn)步驟（一）1 pH 的對酶的影響1） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定準(zhǔn)確稱取 100mgAR 純的葡萄糖，溶于蒸餾水中，定容于100ml 的容量瓶中，配成1.0mg/L 的溶液，水浴加熱5min，迅速取出冷卻，在向每管加入 21.5ml 的蒸餾水于 550nm 處測吸光度；試劑處理試管編號01234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 /ml0.20.40.60.81.01.21.4蒸餾水 /ml2.01.81.61.41.21.00.80.6二硝基水楊

5、酸/ml1.51.51.51.51.51.51.51.53,5- =550nm 的吸光值（ A）2 / 5.2） 取一試管加入 2ml 淀粉并滴加兩滴碘液， 加入適量的酶， 記錄溶液顏色退去的時(shí)間，作為接下來各步反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間t；3） 取十二只試管并編號分別加入2ml 緩沖液加入 2ml，0.1%淀粉，再加入適量的酶，反應(yīng)t 后加入 3,5-二硝基水楊酸 1.5 毫升，水浴加熱 5min，迅速取出冷卻， 在向每管加入 21.5ml的蒸餾水于 550nm 處測吸光度；4） 由 pH 值和吸光度做曲線，找出最適pH 值2 溫度對酶活性的影響1）取十只試管并編號，分別加入 2ml ，0.1%淀粉液和

6、相同量的酶同時(shí)置于 0-100，溫度間隔 10 度，反應(yīng) t 后加入 3,5-二硝基水楊酸 1.5 毫升，水浴加熱 5min，迅速取出冷卻，在向每管加入 21.5ml 的蒸餾水于 550nm 處測吸光度；2）由吸光度和溫度做曲線，找出最適溫度值3 底物濃度對酶活性的影響1）取十只試管并編號并編號1-10，由 1,2 步知最適溫度和最適PH 調(diào)節(jié)溫度PH 值至最合適，然后分別加入0.01%g/ml,0.1%g/ml, ，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml 淀粉溶液 2ml 并加入等量的酶，反應(yīng) t 后加入 3,5-二硝基水楊酸 1.5 毫升，水浴加熱 5min，迅速取出冷

7、卻，在向每管加入 21.5ml 的蒸餾水于 550nm 處測吸光度；2）做吸光度和底物濃度的曲線圖，找出最適底物濃度；4 激活劑和抑制劑對酶活性的影響取三試管并編號123，分別加入 2ml0.1%淀粉溶液，加入最適pH 值3 / 5.的緩沖液并在最適溫度水浴中保溫5min后加入 1m 稀釋的唾液淀粉酶， T 時(shí)間加入 3,5-二硝基水楊酸1.5 毫升，水浴加熱 5min，迅速取出冷卻，在向每管加入21.5ml 的蒸餾水于 550nm 處測吸光度；比較吸光度的大??；（二）酶活力和比活力的測定1)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取十二只試管平行操作試管編號0123450.1mg/l 標(biāo) 準(zhǔn)蛋 -0.010.0

8、30.050.070.09白質(zhì)溶液 /ml考馬斯亮藍(lán)1.001.001.001.001.001.00G-250 試劑0.15molNaCL/ml0.100.090.070.050.030.01混勻， 1h 以內(nèi)已 0 號試管為空白對照，在 595nm 處比色 A2）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線3)定義：酶活力單位：每分鐘生成1mg 葡萄糖所需的酶量4）取一只試管加入一定的酶液（用移液器）加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑 1.00ml，并和 0 號管對比，加 0.15mol/LnaCL 是液面齊平，混勻，1h 以內(nèi)已 0 號試管為空白對照，在595nm 處比色測吸光度；5）根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶蛋白含量；6）調(diào)節(jié) ph