變性蛋白的復(fù)性

1、第十一節(jié)第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性變性蛋白的復(fù)性 以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程藥物時以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程藥物時, ,藥物蛋白通常會形成無活性藥物蛋白通常會形成無活性的蛋白聚體即包含體的蛋白聚體即包含體, ,它們的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列是正確的它們的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列是正確的, ,但空間結(jié)構(gòu)錯誤但空間結(jié)構(gòu)錯誤, ,沒沒有生物學(xué)活性。需要一個復(fù)性過程才能得到生物活性蛋白。有生物學(xué)活性。需要一個復(fù)性過程才能得到生物活性蛋白。 包含體是無定形的蛋白質(zhì)的聚集包含體是無定形的蛋白質(zhì)的聚集, ,不被任何膜所包圍。細胞破碎后不被任何膜所包圍。細胞破碎后, ,包含包含體呈顆粒狀體呈顆粒狀, ,

2、致密致密, ,低速離心就可獲得。低速離心就可獲得。欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物, ,必需分必需分離包含體后離包含體后, ,溶解包含體并使其中的目溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。標蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。包含體的優(yōu)勢：包含體的優(yōu)勢：1 1、富集目標蛋白：包含體具有高密度，、富集目標蛋白：包含體具有高密度，易于分離純化的優(yōu)勢；易于分離純化的優(yōu)勢；2 2、抗蛋白酶：重組蛋白以包含體的形、抗蛋白酶：重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解；白酶對目的蛋白的降解；3 3、對宿主毒性?。荷a(chǎn)那些處于天然

3、、對宿主毒性小：生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象對宿主細胞有毒害的蛋白有優(yōu)勢。構(gòu)象對宿主細胞有毒害的蛋白有優(yōu)勢。一、包含體形成的原因一、包含體形成的原因 主要是高水平表達的結(jié)果。主要是高水平表達的結(jié)果。 在高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白的正確折疊的速率就會導(dǎo)致包含在高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白的正確折疊的速率就會導(dǎo)致包含體的形成。體的形成。 重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等。如折疊酶和分子伴侶等。包含體的組成與特性：包含體的組成與特性： 一般含有一般含有50

4、%50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNARNA聚合酶、外膜蛋白聚合酶、外膜蛋白ompCompC、ompFompF和和ompAompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNADNA，以及脂體、脂多糖等，大小為，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um0.5-1um，無定形，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。，無定形，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。 二、包含體的分離和溶解二、包含體的分離和溶解1 1、包含體的分離、包含體的分離 收集重組菌，破碎細胞；離心除上清；使用變性劑洗滌沉淀。收集重組菌，破碎細胞；離心除上清；使用變性劑洗滌沉淀。

5、2 2、包含體的溶解、包含體的溶解 打斷包含體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈伸展。打斷包含體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈伸展。 溶解采用強的變性劑，如脲、鹽酸溶解采用強的變性劑，如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，胍或硫氰酸鹽，SDSSDS，各種溶解方法都，各種溶解方法都各有利弊。各有利弊。 含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。 加入金屬螯合劑加入金屬螯合劑EDTAEDTA去除金屬離去除金屬離子。子。三、包含體蛋白復(fù)性方法三、包含體蛋白復(fù)性方法幾個幾個 要求：要求：活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收率高

6、正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤的折疊正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤的折疊蛋白質(zhì)分離。蛋白質(zhì)分離。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品產(chǎn)品復(fù)性過程耗時少復(fù)性過程耗時少1 1、稀釋、透析復(fù)性法、稀釋、透析復(fù)性法 蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問題，是在復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問題，是在復(fù)性過程中形成中間體和多聚體，中間體過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，復(fù)性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復(fù)性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復(fù)性。降低蛋白濃度可以減少中間體復(fù)性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復(fù)性率。形成提高復(fù)性率。 方法：在復(fù)性前

7、用使用稀釋、透析、方法：在復(fù)性前用使用稀釋、透析、過濾及凝膠過濾除去變性劑、還原劑。過濾及凝膠過濾除去變性劑、還原劑。將變性蛋白連續(xù)緩慢的加入到復(fù)性緩將變性蛋白連續(xù)緩慢的加入到復(fù)性緩沖液中。復(fù)性中通過透析逐漸減少透沖液中。復(fù)性中通過透析逐漸減少透析緩沖液中的變性劑濃度。析緩沖液中的變性劑濃度。 復(fù)性緩沖液的復(fù)性緩沖液的pHpH要遠離等電點；離要遠離等電點；離子強度不易過高，子強度不易過高，10-50mmol/L10-50mmol/L，離子，離子強度太高蛋白質(zhì)易發(fā)生沉淀，也不利強度太高蛋白質(zhì)易發(fā)生沉淀，也不利于離子交換層析的分離；復(fù)性液溫度于離子交換層析的分離；復(fù)性液溫度不易過高在不易過高在4-

8、104-10較合適，對于耐較合適，對于耐熱蛋白也可以室溫復(fù)性；復(fù)性時間，熱蛋白也可以室溫復(fù)性；復(fù)性時間，以天然表達的重組蛋白復(fù)性應(yīng)在以天然表達的重組蛋白復(fù)性應(yīng)在6hr6hr以以上。上。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個蛋白質(zhì)都有一件大不相同。任何一個蛋白質(zhì)都有一個最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合個最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順疊

9、，才能使進一步的層析分離得以順利完成。利完成。 分子量，等電點，二硫鍵。分子量，等電點，二硫鍵。稀釋復(fù)性方案如下：稀釋復(fù)性方案如下：8M8M尿素變性，尿素變性，3737度度2h2h。 50mM Tris pH8.0 50mM Tris pH8.0 ，50mM Nacl50mM Nacl，1mM EDTA 1mM EDTA ，1% Gly1% Gly，10%10%甘油復(fù)性，甘油復(fù)性，1/1001/100稀釋復(fù)性，稀釋復(fù)性，1%1%蛋白，室溫過夜，蛋白，室溫過夜，16h16h。DEAEDEAE柱富集，新膠上柱后，用柱富集，新膠上柱后，用0.5M NaoH0.5M NaoH，8M urea8M ur

10、ea，洗脫蛋白。，洗脫蛋白。2 2、含有二硫鍵的蛋白的復(fù)性、含有二硫鍵的蛋白的復(fù)性 復(fù)性時涉及正確二硫鍵（分子內(nèi)或復(fù)性時涉及正確二硫鍵（分子內(nèi)或者分子間）的重建。者分子間）的重建。 空氣氧化法加入氧化劑空氣氧化法加入氧化劑- -還還原轉(zhuǎn)換試劑原轉(zhuǎn)換試劑 加入氧化型谷胱甘肽加入氧化型谷胱甘肽使用還原劑保護巰基加入二硫蘇糖使用還原劑保護巰基加入二硫蘇糖醇。醇。3 3、封閉蛋白的疏水簇促進復(fù)性、封閉蛋白的疏水簇促進復(fù)性 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列的分析，確對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列的分析，確定出在蛋白中可能引起分子間相互作定出在蛋白中可能引起分子間相互作用的疏水簇。用特異性結(jié)合疏水簇的用的疏水簇。用特異性結(jié)合疏水簇

11、的單克隆抗體來封閉疏水簇，減少分子單克隆抗體來封閉疏水簇，減少分子間結(jié)合引起的聚集。間結(jié)合引起的聚集。4 4、凝膠過濾層析復(fù)性、凝膠過濾層析復(fù)性 層析介質(zhì)的隔離作用，降低了層析介質(zhì)的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集，使復(fù)蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集，使復(fù)性濃度、復(fù)性率得到很大的提高。性濃度、復(fù)性率得到很大的提高。5 5、小分子添加劑促進復(fù)性、小分子添加劑促進復(fù)性 可以抑制蛋白聚集體的產(chǎn)生，可以抑制蛋白聚集體的產(chǎn)生，可以穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)，降低非正可以穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)，降低非正確折疊蛋白的穩(wěn)定性等作用。確折疊蛋白的穩(wěn)定性等作用。6 6、分子伴侶或折疊酶促進的復(fù)性、分子伴侶或折疊酶促進的

12、復(fù)性7 7、人工分子伴侶促進的復(fù)性、人工分子伴侶促進的復(fù)性分子量，等電點，二硫鍵分子量，等電點，二硫鍵, , 疏水結(jié)構(gòu)疏水結(jié)構(gòu) 1PBS或生理鹽水洗滌菌體，Buffer A重懸菌體，超聲波破碎至清亮。 4 ，10000rpm離心10min，棄上清。 用PBS或生理鹽水洗滌沉淀2-3次。 往沉淀中加 Buffer A及20的SKL（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置30min至h。 4，10000rpm離心10min，取上清。 加20PEG4000至終濃度為0.2，加50mM的氧化型谷胱甘肽至終濃度為mM,加100mM的還原型谷胱甘肽至終濃度為mM,靜置30min至h（亦

13、可復(fù)性過夜）。 . 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20保存?zhèn)溆谩?8 .檢驗復(fù)性是否成功。 Buffer A配方： Tris-base 50mM,EDTA 0.5mM,NaCl 50mM, 甘油5% ,DTT 5mM 第十二節(jié)第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制 是利用活細胞作為表達系統(tǒng)，是利用活細胞作為表達系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴重危害。嚴重危害。 宿主細胞中表達的外源基因

14、，在轉(zhuǎn)錄翻譯精宿主細胞中表達的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質(zhì)量。及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質(zhì)量。一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點一般性要點1 1、產(chǎn)品安全性評價、產(chǎn)品安全性評價2 2、產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)、產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)3 3、嚴格控制條件、嚴格控制條件二、生物材料的質(zhì)量控制二、生物材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNADNA序列的正確性序列的正確性，重組微生，重組微生物來自物來自單一克隆單一

15、克隆，所用質(zhì)粒，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。包，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。包括對目的基因、表達載體、宿主細胞的檢查。括對目的基因、表達載體、宿主細胞的檢查。根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性: :目的基因：明確目的基因的目的基因：明確目的基因的來源、來源、克隆經(jīng)過克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；譜和核苷酸序列予以確證；表達載體：應(yīng)提供表達載體的表達載體：應(yīng)提供表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、（如復(fù)制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所

16、用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物; ;宿主細胞：應(yīng)提供宿主細胞的宿主細胞：應(yīng)提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特及其生物學(xué)特性性須闡明須闡明載體引入載體引入宿主細胞的宿主細胞的方法方法及載體在宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；及載體在宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中中啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方法及水平啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方

17、法及水平等。等。三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定； 在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變； 在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定； 始終能排除外源微生物污染。始終能排除外源微生物污染。 生產(chǎn)用細胞庫：生產(chǎn)用細胞庫：生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并

18、由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫。種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫。 原始種子批須確證克隆基因原始種子批須確證克隆基因DNADNA序列，詳序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，細敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。保存與復(fù)蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細敘述細胞生對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細敘述細胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細胞量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細胞- -載體系載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；統(tǒng)穩(wěn)定性，確

19、定最高允許傳種代數(shù)； 培養(yǎng)過程：培養(yǎng)過程：在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達基在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；宿主細胞特征；宿主細胞- -載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。 培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細胞培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細胞- -載體系載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。四、純化

20、過程的質(zhì)量控制四、純化過程的質(zhì)量控制 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、性；外源蛋白質(zhì)、DNADNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。 在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。五、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制五、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制 基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾

21、項要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。 它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。 重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒別方法重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒別方法 電泳方法：電泳方法： SDS-PAGE,SDS-PAGE,等電聚焦，等電聚焦， 免疫電泳免疫電泳 免疫學(xué)方法：免疫學(xué)方法：RIA, RIDRIA, RID，ELISA,Immunoblotting ELISA,Immunoblot

22、ting 受體結(jié)合實驗（受體結(jié)合實驗（ Receptor BindingReceptor Binding） 各種高效液相分析法（各種高效液相分析法（HPLCHPLC） 肽圖分析法肽圖分析法 Edman N Edman N 末端序列分析法末端序列分析法 圓二色譜（圓二色譜（CDCD） NMR NMR 1.1.生物活性測定：生物活性測定：需要動物體內(nèi)實驗和通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定。需要動物體內(nèi)實驗和通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定。 體內(nèi)生物學(xué)活性的測定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型，體外體內(nèi)生物學(xué)活性的測定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型，體外生物活性測定有細胞計數(shù)

23、法等。生物活性測定有細胞計數(shù)法等。 重組蛋白質(zhì)是一種抗原，可用放射免疫分析法或酶標法測定其免疫學(xué)活性。重組蛋白質(zhì)是一種抗原，可用放射免疫分析法或酶標法測定其免疫學(xué)活性。 效價測定必須采用國際上通用的方法，測定結(jié)果須用國際或國家標準品進行校正，以國際單位表示或折算成國際單位標準。 蛋白的比活性是每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，是重組蛋白質(zhì)的一項重要指標，不僅是含量指標，也是純度指標。 2.2.理化性質(zhì)鑒定理化性質(zhì)鑒定 肽圖分析：肽圖分析：用酶法和化學(xué)方法降解目的蛋白，對生成的肽段進行分離分析，是檢測用酶法和化學(xué)方法降解目的蛋白，對生成的肽段進行分離分析，是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細微變化的最有效方法。靈敏

24、、高效。高效液相色譜和毛細管電蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細微變化的最有效方法。靈敏、高效。高效液相色譜和毛細管電泳。泳。氨基酸成分分析：氨基酸成分分析：小于小于5050個氨基酸分析結(jié)果較可靠。個氨基酸分析結(jié)果較可靠。部分氨基酸序列分析：部分氨基酸序列分析：氨基端氨基端1515個氨基酸。個氨基酸。重組蛋白質(zhì)的濃度測定：重組蛋白質(zhì)的濃度測定：凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林- -酚法和紫酚法和紫外光譜法。外光譜法。相對分子量測定：相對分子量測定：凝膠過濾法（完整）和凝膠過濾法（完整）和SDS-PAGESDS-PAGE法（亞基）。法（亞基）。雜質(zhì)檢驗：雜質(zhì)檢

25、驗：包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 蛋白類：宿主細胞蛋白，采用免疫方法和電泳相結(jié)合；蛋白類：宿主細胞蛋白，采用免疫方法和電泳相結(jié)合； 非蛋白類：病毒、細菌等微生物、熱源質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原及非蛋白類：病毒、細菌等微生物、熱源質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原及DNADNA。利用微生物。利用微生物學(xué)方法檢測無菌。熱源質(zhì)檢測用家兔注射。學(xué)方法檢測無菌。熱源質(zhì)檢測用家兔注射。 穩(wěn)定性考察：穩(wěn)定性考察：是評價藥品有效性和安全性的重要指標，也是確定藥品儲藏條件和是評價藥品有效性和安全性的重要指標，也是確定藥品儲藏條件和使用期限的主要依據(jù)。對溫度、氧化、光照、離子濃度和機械剪切等環(huán)境因素都使用期限的主

26、要依據(jù)。對溫度、氧化、光照、離子濃度和機械剪切等環(huán)境因素都很敏感。很敏感。產(chǎn)品一致性保證：產(chǎn)品一致性保證：生產(chǎn)周期長，影響因素多，必須對每一步都進行嚴格的控制。生產(chǎn)周期長，影響因素多，必須對每一步都進行嚴格的控制。 基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法 雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法 內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱源法 宿主細胞蛋白 免疫分析、SD-PAGE、CE 其他蛋白雜質(zhì)（如培養(yǎng)基） SDS-PAGE、HPLC、CE、免疫分析 殘余DNA DNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合 蛋白變異 肽譜、HPLC、IEF、CE 甲酰基甲硫氨酸 肽譜、HPLC、IEF、

27、CE 甲硫氨酸氧化 肽譜、氨基酸分析、HPLC、質(zhì)譜、Edman分析 產(chǎn)物變性或聚合脫氨基 SDS-PAGE、凝膠排阻色譜、IEF、HPLC、CE Edman分析、CE 單克隆抗體（親和配基脫落） SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽譜、CE、Edman分析、質(zhì)譜 微生物（細菌、酵母、真菌） 微生物學(xué)檢查 支原體 微生物學(xué)檢查 病 毒 微生物學(xué)檢查六、產(chǎn)品的保存六、產(chǎn)品的保存 防止變性，降解，保護其活性中心。防止變性，降解，保護其活性中心。 液態(tài)保存液態(tài)保存 （1 1）低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在）低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-10-10到到- -2 20C以下冰凍保存。以下冰凍

28、保存。 （2 2）在穩(wěn)定）在穩(wěn)定pHpH條件下保存：蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的條件下保存：蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的pHpH一般在等電點，且多數(shù)蛋白質(zhì)只有在很窄的一般在等電點，且多數(shù)蛋白質(zhì)只有在很窄的pH pH 范圍內(nèi)才穩(wěn)定。因此對保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時小范圍內(nèi)才穩(wěn)定。因此對保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時小心調(diào)到其穩(wěn)定的心調(diào)到其穩(wěn)定的pH pH 范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。 液態(tài)保存液態(tài)保存 （3 3）高濃度保存：一般蛋白質(zhì)在高濃度時比較穩(wěn)定，因為液態(tài)蛋白質(zhì)容易受）高濃度保存：一般蛋白質(zhì)在高濃度時比較穩(wěn)定，因為液態(tài)蛋白質(zhì)容易受水化作用的影響，濃度太低易引起亞基解離和表面變性。水化作用的影響，濃度太低易引起亞基解離和表面變性。 （4 4）加保

29、護劑保存：多元醇、有機溶劑、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。）加保護劑保存：多元醇、有機溶劑、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。 2 2、固態(tài)保存、固態(tài)保存 一般蛋白質(zhì)含水量超過一般蛋白質(zhì)含水量超過10%10%時容易失活。含水量降到時容易失活。含水量降到5%5%時，在室溫或冰箱中時，在室溫或冰箱中保存均比較穩(wěn)定，但在保存均比較穩(wěn)定，但在3737C C保存時活性明顯下降。長期保存蛋白質(zhì)的最好方法保存時活性明顯下降。長期保存蛋白質(zhì)的最好方法是制成干粉或結(jié)晶。凍干粉或結(jié)晶都具有強抗熱性和穩(wěn)定性，放在干燥器中在是制成干粉或結(jié)晶。凍干粉或結(jié)晶都具有強抗熱性和穩(wěn)定性，放在干燥器中在4 4C C可保存相當(dāng)長的時間。可保存相當(dāng)

30、長的時間。主要內(nèi)容：基因工程制藥的基本過程。目的基因的獲得及基因的表達。基因工程菌的生長代謝特點，其質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因及提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。基因工程菌的培養(yǎng)方式，發(fā)酵工藝及培養(yǎng)設(shè)備。高密度發(fā)酵基因工程藥物的分離純化。變性蛋白的復(fù)性基因工程藥物的質(zhì)量控制。1 1、稀釋、透析復(fù)性法、稀釋、透析復(fù)性法 蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問題，是在復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問題，是在復(fù)性過程中形成中間體和多聚體，中間體過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，復(fù)性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復(fù)性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復(fù)性。降低蛋白濃度可以減少中間體復(fù)性。降低

31、蛋白濃度可以減少中間體形成提高復(fù)性率。形成提高復(fù)性率。 4 4、凝膠過濾層析復(fù)性、凝膠過濾層析復(fù)性 層析介質(zhì)的隔離作用，降低了層析介質(zhì)的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集，使復(fù)蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集，使復(fù)性濃度、復(fù)性率得到很大的提高。性濃度、復(fù)性率得到很大的提高。一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點一般性要點1 1、產(chǎn)品安全性評價、產(chǎn)品安全性評價2 2、產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)、產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)3 3、嚴格控制條件、嚴格控制條件根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性: :目的基因：明確目的基因的目的基因：明確目的基因的來源、來源、克隆經(jīng)過克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；譜和核苷酸序列予以確證； 培