出入境檢驗(yàn)檢疫局液相色譜崗位分析

1、中華人民共和國安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局 The Chemical Laboratory of AHCIQ 標(biāo)準(zhǔn)操作程序Standard Operation Procedure液相色譜崗位分析方法性能標(biāo)準(zhǔn)、其他要求和步驟Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results at LC PostTimes new roman小二號居中方法編號SOP-LC-XXX批準(zhǔn)人起草人版本/版次簽發(fā)人修訂次數(shù)簽發(fā)日期驗(yàn)證人實(shí)施日期驗(yàn)證日期安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局化學(xué)技術(shù)中心液相色譜崗位分析方法性能標(biāo)準(zhǔn)、其他

2、要求和步驟1定義1.1 準(zhǔn)確度檢測結(jié)果與可接受參考值之間的符合度。通過測定真實(shí)性和精密度來確定。1.2 誤差指測試樣品符合規(guī)定的概率，盡管獲得的是不符合規(guī)定的測定(是一個(gè)假的不符合規(guī)定的決定)。1.3 分析物將要檢測、鑒別和/或定量的物質(zhì)以及分析過程中產(chǎn)生的衍生物。1.4 誤差測試樣品確實(shí)不符合規(guī)定的概率，盡管獲得的是符合規(guī)定的測定(是一個(gè)假的符合規(guī)定的決定)。1.5 偏差指檢測結(jié)果與可接受參考值之間的差異。1.6 標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)用參考基準(zhǔn)值的測量值來代表所測物質(zhì)量的測量手段。1.7 認(rèn)證過的基準(zhǔn)物質(zhì)(CRM)CRM指一種有特定分析物含量賦值的物質(zhì)材料。1.8 共色譜法指一個(gè)將提取物在進(jìn)行色譜分離之

3、前分成兩個(gè)部分的過程。第一部分進(jìn)行色譜分離。第二部分與要測定的標(biāo)準(zhǔn)分析物混合。然后將該混合物也進(jìn)行色譜分離。所加標(biāo)準(zhǔn)分析物的量必須與提取物中分析物的估計(jì)值相差不大。設(shè)計(jì)此方法是要提高采用色譜法時(shí)分析物的鑒別，特別是在沒有適宜的內(nèi)標(biāo)物可用時(shí)。1.9 協(xié)同試驗(yàn)用相同的方法對相同的樣品進(jìn)行分析以確定該方法的性能特性。該試驗(yàn)包括隨機(jī)測定誤差和實(shí)驗(yàn)室偏差。1.10 確認(rèn)方法能提供全面或補(bǔ)充信息使物質(zhì)得到明確地鑒定，并且能在感興趣的水平進(jìn)行定量的方法。1.11 決定限度(CC)CC指等于和高于此值時(shí)，可以用誤差概率得出認(rèn)為樣品不符合規(guī)定的結(jié)論的限度。1.12 檢測容量(CC)CC指可以用誤差概率檢測、鑒別

4、和或定量樣品中物質(zhì)的最小含量。對于未確定允許限量的物質(zhì)，檢測容量是指用1統(tǒng)計(jì)學(xué)概率方法能夠檢測出真正污染的樣品的最低濃度。對于已經(jīng)建立允許限量的物質(zhì)，檢測容量則是指用1統(tǒng)計(jì)學(xué)概率方法能夠檢測出允許限量濃度的濃度。1.13 添加樣品材料被已知量的待測物強(qiáng)化的樣品。1.14實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)(比對)由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室依照預(yù)先確定的測定檢測性能條件，對同樣品的檢測進(jìn)行組織、性能和評價(jià)測試。根據(jù)目的，試驗(yàn)可以分為協(xié)作試驗(yàn)和熟練程度試驗(yàn)。1.15 內(nèi)標(biāo)(IS)一種理化特性與待測分析物盡可能相同，并且樣品中不存在的物質(zhì)。它被加到每份樣品中及每一個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)中。1.16 實(shí)驗(yàn)室樣品被送到實(shí)驗(yàn)室作檢查和測試而準(zhǔn)備的一

5、種樣品。1.17 關(guān)心水平樣品中明顯地確定其符合法規(guī)規(guī)定的物質(zhì)或分析物的濃度。1.18 最低要求性能限度(MRPL)樣品中至少必須檢測和確認(rèn)的分析物的最低含量。1.19 性能特點(diǎn)可以歸結(jié)于分析方法的使用特點(diǎn)。這可以是特異性、準(zhǔn)確性、真實(shí)性、精密度、重復(fù)性、重現(xiàn)性、回收率、檢測性能和抗耐性。1.20 分析方法的性能標(biāo)準(zhǔn)可以來判斷該方法是否適合于其目的、并產(chǎn)生可靠結(jié)果的性能特點(diǎn)要求。1.21 允許限度法規(guī)中確定的物質(zhì)的最高殘留限量、最高水平和其他最大耐受量。1.22 精密度在規(guī)定(預(yù)先確定)條件下，獲得的相互獨(dú)立的檢測結(jié)果之間的一致程度。精密度測定通常用不精確性表示并以檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差來計(jì)算。標(biāo)

6、準(zhǔn)偏差大則精密度就低。1.23 熟練試驗(yàn)允許實(shí)驗(yàn)室選擇其自己的方法來分析同一個(gè)樣品，假設(shè)這些方法在常規(guī)條件下使用。試驗(yàn)必須按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序來設(shè)計(jì)或執(zhí)行，并可用來評價(jià)方法的重現(xiàn)性。1.24 定性方法一種可以根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)、生物學(xué)或物理特性鑒別該物質(zhì)的分析方法。1.25 定量方法一種可以確定物質(zhì)的數(shù)量或質(zhì)量特性，以便可以用適當(dāng)單位的數(shù)值表示的分析方法。1.26 試劑空白測定不用測試物或用相當(dāng)數(shù)量的溶劑替代測試物而進(jìn)行的全部分析過程。1.27 回收率在分析過程中回收到物質(zhì)的實(shí)際濃度百分比。如果是沒有認(rèn)證過的基準(zhǔn)物質(zhì)，應(yīng)在方法確認(rèn)試驗(yàn)中予以測定。1.28 基準(zhǔn)物質(zhì)指其一種或幾種特性已經(jīng)被確認(rèn)方法

7、所證實(shí)，從而可以用來校正設(shè)備或校驗(yàn)測定方法的物質(zhì)。1.29 重復(fù)性在重復(fù)條件下的精密度。1.30 重復(fù)條件在同一個(gè)試驗(yàn)室由同一個(gè)操作人，用相同的儀器、相同的方法對同一個(gè)檢測項(xiàng)目進(jìn)行檢測，獲得的獨(dú)立檢測結(jié)果的條件。1.31 重現(xiàn)性在重現(xiàn)條件下的精密度。1.32 重現(xiàn)條件在不同試驗(yàn)室由不同的操作人，用不同的儀器、相同的方法對同一個(gè)檢測項(xiàng)目進(jìn)行檢測，獲得的獨(dú)立檢測結(jié)果的條件。1.33 抗耐性分析方法對試驗(yàn)條件，可以表示為樣品材料、分析物、貯存條件、環(huán)境和或樣品制備條件等改變的敏感性，在此條件下，該方法可以按現(xiàn)有方法應(yīng)用或作特別的輕微修正。對于實(shí)際中可能遇到的各種變化(如試劑的穩(wěn)定性、樣品的組分、酸度

8、、溫度)的所有試驗(yàn)條件，任何能夠影響分析結(jié)果的變化都應(yīng)盡可能的指出。1.34 樣品空白測定對不含分析物的樣品的測試部分進(jìn)行的完整分析過程。1.35 篩選方法用來測定關(guān)注水平的某一物質(zhì)或某類物質(zhì)的存在方法。這些方法具有對樣品的高吞吐量能力，并被用來對大量的樣品進(jìn)行審定，以確定是否潛在地不符合規(guī)定。它們應(yīng)該特別地設(shè)計(jì)，以避免出現(xiàn)符合的假結(jié)果。1.36 單一實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(室內(nèi)確認(rèn))一種由一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在適當(dāng)長的時(shí)間間隔內(nèi)，在不同的條件下，用一種方法來分析相同或不同的測試材料的分析試驗(yàn)。1.37 特異性一種區(qū)別被測分析物與其他物質(zhì)的能力的方法。這種特性是所述測定技術(shù)的主要功能，但是可以根據(jù)化合物或基質(zhì)的類別

9、而變化。1.38 標(biāo)準(zhǔn)添加指測試樣品被分為兩個(gè)(或多個(gè))測試部分的過程。其中一部分直接分析，另一部分在分析前被添加了已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)分析物。所加標(biāo)準(zhǔn)分析物的量必須是樣品中估計(jì)的分析物的量的2 倍到5 倍之間?？紤]到分析過程的回收率，設(shè)計(jì)此步驟是要確定樣品中的分析物的含量。1.39 標(biāo)準(zhǔn)分析物一種已知的，并被認(rèn)證過含量和純度，用作分析中參照物的分析物。1.40 物質(zhì) 特定的或有確定化學(xué)組成的物質(zhì)及其代謝物。1.41 測試部分指從進(jìn)行檢測或觀察的測試樣品分出的物質(zhì)的量。1.42 測試樣品指由一種實(shí)驗(yàn)室樣品制備，并由此獲取測試部分的一種樣品。1.43 真實(shí)度從大量的測試結(jié)果獲得的平均值與可接受的參照值

10、之間的符合程度。真實(shí)度通常以偏差表示。1.44 單位指ISO 31(20)和歐盟指令71/354/EC 中所述的那些單位。1.45 確認(rèn)通過檢查和提供有效的證據(jù)，以確定一個(gè)特定計(jì)劃應(yīng)用的具體要求得到實(shí)行。1.46 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性在同一個(gè)試驗(yàn)室，在適當(dāng)長的時(shí)間間隔內(nèi)和在規(guī)定(預(yù)先確定)的條件下(涉及到如方法、測試材料、操作人員、環(huán)境)獲得的精密度。2. 分析方法性能標(biāo)準(zhǔn)和其他要求2.1 總體要求2.1.1 樣品處理樣品應(yīng)該以有最大機(jī)會(huì)檢測出物質(zhì)的方式獲得、處理和加工。樣品處理過程應(yīng)防止偶然污染或丟失分析物的可能性。2.1.2 方法性能2.1.2.1 回收率在樣品分析過程中，如果采用了一個(gè)固定的回

11、收率校正因子，則應(yīng)對每一批樣品測定回收率。如果回收率在限度以內(nèi)，才能采用固定的回收率校正因子。否則，應(yīng)采用從該批樣品獲得的特定回收率因子，除非采用標(biāo)準(zhǔn)添加程序(見3.5)或用內(nèi)標(biāo)法來定量測定樣品中分析物，才可應(yīng)用樣品中分析物的特定回收率因子。2.1.2.2 特異性在試驗(yàn)條件下一個(gè)方法應(yīng)能區(qū)分分析物和其他物質(zhì)之間的差別。必須提供這種區(qū)別估計(jì)可能達(dá)到的程度。當(dāng)采用所述的測定技術(shù)時(shí)需要克服任何可預(yù)見的來自物質(zhì)(如同族物、同類物、要檢測的殘留物)代謝產(chǎn)物的干擾。特別重要的是要調(diào)查來自基質(zhì)組分的干擾。2.2 篩選方法只有那些以記錄的可追溯方式證明其有效，并且在測定的水平假符合串5(誤差)的分析技術(shù)才可用

12、于指令96/23/EC 規(guī)定的篩選目的。在出現(xiàn)可疑結(jié)果時(shí)，應(yīng)用確認(rèn)方法進(jìn)行確認(rèn)。2.3 有機(jī)殘留物和污染物的確認(rèn)方法有機(jī)殘留物或污染物的確認(rèn)方法應(yīng)提供關(guān)于分析物化學(xué)結(jié)構(gòu)的信息。因此僅根據(jù)色譜分析而不采用光譜檢測的方法不適于單獨(dú)作為確認(rèn)方法。但是，如果一個(gè)技術(shù)缺乏足夠的特異性，應(yīng)該通過包括合適的凈化，色譜分離和光譜檢測等分析技術(shù)來達(dá)到所需的特異性。以下方法或方法聯(lián)合被認(rèn)為是適于鑒定所指定的物質(zhì)組的有機(jī)殘留物或污染物。表1 有機(jī)殘留物或污染物的確認(rèn)方法（液相色譜部分）測定技術(shù)96/23/EC附錄I物質(zhì)限度帶有質(zhì)譜檢測的液譜A 和B 組只要符合或在線或離線色譜分離只要采用全掃描技術(shù)或采用至少3（B組

13、）或4（A 組）個(gè)鑒別點(diǎn)作為不記錄全部質(zhì)譜的技術(shù)帶紅外光譜檢測的液譜A 和B 組必須滿足紅外光譜吸收的特殊要求帶二級管矩陣檢測全程掃描的液譜B 組必須滿足紫外光譜吸收的特殊要求帶熒光檢測的液譜B 組只適用于自然發(fā)射熒光的分子和經(jīng)過轉(zhuǎn)化或衍生后發(fā)射熒光的分子帶紫外/可見光檢測（單一波長）的液譜B 組只要采用至少兩個(gè)不同的色譜系統(tǒng)或第二個(gè)獨(dú)立的檢測方法2.3.1 共同的性能標(biāo)準(zhǔn)和要求確認(rèn)方法應(yīng)提供關(guān)于分析物化學(xué)結(jié)構(gòu)的信息。當(dāng)有一個(gè)以上化合物給出相同反應(yīng)時(shí)，那么該方法不應(yīng)區(qū)別不開這些化合物。僅根據(jù)色譜分析而不采用光譜檢測的方法不適于單獨(dú)作為確認(rèn)方法。如果在方法中使用內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)在提取過程開始時(shí)就

14、加入到測試部分。根據(jù)可能性，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的分析物特別適用于質(zhì)譜檢測，或結(jié)構(gòu)與分析物類似的化合物。當(dāng)沒有適宜的內(nèi)標(biāo)物可用時(shí)，分析物的鑒別應(yīng)采用混合色譜來確認(rèn)。此時(shí)，只需獲得一個(gè)峰，增高的峰的高度(或面積)應(yīng)等于加入的分析物的量。對于LC，半峰高處的峰寬應(yīng)在原始峰寬的90110范圍內(nèi)，保留時(shí)間應(yīng)在5范圍內(nèi)變化。參照物或含有等于或接近允許限度或判定限度(超標(biāo)控制對照樣品)的已知量的分析物添加材料，以及陰性控制材料和試劑空白最好應(yīng)當(dāng)在整個(gè)過程中與每一批分析的樣品一塊進(jìn)行操作。注入提取物到分析儀器的順序如下：試劑空白，陰性控制材料，需要確認(rèn)的樣品，陰性控制材料，最后是超標(biāo)控制對照樣品。任

15、何與這種順序不同的變化應(yīng)被證明是適宜的。2.3.2 對定量分析方法的額外性能標(biāo)準(zhǔn)和其他要求2.3.2.1 定量方法的真實(shí)度在重復(fù)分析己鑒定的參照材料時(shí)，試驗(yàn)測定的回收率折算己知值的平均質(zhì)量范圍的指導(dǎo)范圍如表2。表2 定量方法的最低真實(shí)度真值含量（mg/kg）偏差范圍（%）0.001-50 +200.0010.01-30 +100.01010-20 +101010001510001000010100005在沒有認(rèn)證過的基準(zhǔn)物質(zhì)可使用時(shí)，通過向空白基質(zhì)中加入已知量的分析物得到的回收率來評價(jià)測定的真實(shí)度是可以接受的。用平均回收率折算的數(shù)據(jù)只有落在表2 所示的范圍內(nèi)才可接受。2.3.2.2 定量方法的

16、精密度對于測試物中的禁用物質(zhì)，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限三個(gè)水平進(jìn)行；對于已制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測定低限、MRL、選一合適點(diǎn)三個(gè)水平進(jìn)行；對于未制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測定低限、常見限量指標(biāo)、選一合適點(diǎn)三個(gè)水平進(jìn)行。重復(fù)測定次數(shù)至少為6。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變異系數(shù)參考范圍見表3。表3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)被測組分含量實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV，%）0.1 µg/kg431 µg/kg3010 µg/kg21100 µg/kg151 mg/kg1110 mg/kg7.5100 mg/kg5.31000 mg/kg3

17、.81 %2.710 %2.0100 %1.3注：對于低于100g/kg的質(zhì)量范圍，用Horwitz 公式計(jì)算會(huì)得出不可接受的高值。因此，歐盟對低于100g/kg 的質(zhì)量范圍時(shí)僅其CVs應(yīng)盡可能地低。液相色譜工作崗位依據(jù)GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測執(zhí)行此要求。對于在重復(fù)性條件下進(jìn)行的分析，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV應(yīng)特別地位于上述數(shù)值的1/22/3之間。對于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性條件下進(jìn)行的分析，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的CV不應(yīng)大于重現(xiàn)性CV。對于有規(guī)定的允許限度的物質(zhì)，方法應(yīng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重現(xiàn)性不大于在0.5 倍允許限度的濃度時(shí)相應(yīng)得到的重現(xiàn)性CV。2.3.3 質(zhì)譜檢測性能標(biāo)準(zhǔn)和其他要求質(zhì)

18、譜分析作為確證方法適合的原則是僅用于在線或離線色譜分離之后。2.3.3.1 色譜分離對LC-MS 操作，色譜分離應(yīng)該選用合適的液相色譜柱。在任何情況下，檢測條件下分析物最小可接受的保留時(shí)間是色譜柱死體積相應(yīng)保留時(shí)間的二倍。測試部分分析物的保留時(shí)間(相對保留時(shí)間)應(yīng)在特定保留時(shí)間平臺(tái)內(nèi)與校正的標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間一致。保留時(shí)間平臺(tái)應(yīng)與色譜儀分辨率相當(dāng)。分析物色譜保留時(shí)間和內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間的比率，即分析物的相對保留時(shí)間應(yīng)與校準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間LC在土2.5%的允許誤差一致。2.3.3.2 質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測應(yīng)當(dāng)使用質(zhì)譜技術(shù)，如全質(zhì)譜記錄(全掃描)或選擇離子監(jiān)控(SIM)，MS-MSn技術(shù)如選擇多反應(yīng)監(jiān)控(MRM

19、)或其他合適的MS、MS-MSn 技術(shù)與合適的離子化模式聯(lián)合使用。在高分辨率質(zhì)譜(HRMS)中，全質(zhì)譜范圍10%峰谷上分辨率應(yīng)典型地超過10000。全掃描：當(dāng)質(zhì)譜檢測是通過執(zhí)行全掃描光譜記錄時(shí)，所有出現(xiàn)的測量診斷離子(分子離子、分子離子的特征加和物、特征碎片離子和同位素離子)的相對豐度超過校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品參照光譜豐度的10是必須的。選擇離子監(jiān)控(SIM)：當(dāng)質(zhì)譜檢測是通過執(zhí)行碎片譜時(shí)，分子離子可能是更適宜的測量診斷離子之一(分子離子、分子離子的特征加和離子、特征碎片離子、同位素離子)。選擇的診斷離子不應(yīng)該是起源于分子的相同部分。每一診斷離子的信噪比(S/N)應(yīng)大于3。全掃描和選擇離子監(jiān)控：檢測離子的

20、相對豐度，用最強(qiáng)的離子或透過率的百分?jǐn)?shù)表示。應(yīng)該與校準(zhǔn)物質(zhì)、校準(zhǔn)物質(zhì)溶液或吸取的樣品溶液在可比較的濃度下和相同的條件下測定。離子強(qiáng)度應(yīng)符合以下限度：表4 質(zhì)譜技術(shù)中相對離于強(qiáng)度的最大允許限度范圍相對強(qiáng)度(基線峰的)液相色譜多級質(zhì)譜LC-MS，LC-MSn50±202050±251020±3010±50質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解釋：診斷離子和/或母離子/產(chǎn)物離子對必須通過比較光譜或單一質(zhì)量跟蹤信號的積分來鑒定。任何使用背景校正時(shí)，應(yīng)在整批的測定規(guī)程中(見2.3.1，第四段)采用背景校正，并被清楚的指出。全掃描：在單一質(zhì)譜圖中全掃描光譜被記錄時(shí)，至少存在4 個(gè)相對強(qiáng)度10

21、基線峰的離子，如果分子離子在參照光譜中相對強(qiáng)度10，則分子離子峰必須包括在內(nèi)。至少4個(gè)離子位于相對離子強(qiáng)度的最大允許范圍內(nèi)(見表5)。計(jì)算機(jī)幫助的圖庫查詢可以使用（如果有的情況下）。在這種情況下，測試樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較必須超過關(guān)鍵匹配因子。該因子將在對每一分析物光譜的確證過程和基本標(biāo)準(zhǔn)描述完成時(shí)被測定。光譜中由樣品基質(zhì)和檢測器性能引起的變異性應(yīng)該得到檢查。選擇離子監(jiān)控(SIM)：當(dāng)質(zhì)譜碎片被非全掃描技術(shù)所測量時(shí)，一系列的識別點(diǎn)將用于解釋數(shù)據(jù)。96/23/EC 指令附錄的A 組的物質(zhì)的確認(rèn)需要最少4 個(gè)識別點(diǎn)，96/23/EC 指令附錄的B 組的物質(zhì)的確認(rèn)需要最少3個(gè)識別點(diǎn)

22、。表5為每一種最基本的質(zhì)譜技術(shù)能夠獲得的識別點(diǎn)數(shù)量。然而，為了使需要確認(rèn)的識別點(diǎn)具有資格，識別點(diǎn)的總和可以按以下計(jì)算：(a)最小至少一個(gè)離子對被測定：(b)所有相對測定的離子對滿足上述描述的標(biāo)準(zhǔn)；(c)最多三個(gè)獨(dú)立技術(shù)能聯(lián)合使用達(dá)到最小識別點(diǎn)數(shù)。表 5 質(zhì)譜碎片分類范圍和所獲得的識別點(diǎn)之間的關(guān)系質(zhì)譜技術(shù)獲得每一離子的鑒別點(diǎn)數(shù)低分辨率質(zhì)譜(LR)1.0低分辨率質(zhì)譜多級質(zhì)譜母離子1.0低分辨率質(zhì)譜多級質(zhì)譜轉(zhuǎn)換產(chǎn)物1.5高分辨率質(zhì)譜(HRMS)2.0高分辨多級質(zhì)譜母離子2.0高分辨多級質(zhì)譜轉(zhuǎn)換產(chǎn)物2.5注解：(1)每一種離子只能計(jì)算一次： (2)使用不同的化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的衍生物可以用于增加不同分析物的

23、識別點(diǎn)數(shù)；(3)對96/23/EC 指令下附錄I的A組的物質(zhì)，如果在分析過程中以下技術(shù)之一被使用，且該技術(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)己完成，則可以貢獻(xiàn)最多一個(gè)識別點(diǎn)。HPLC 與全掃面二極管點(diǎn)陣(DAD)連用：HPLC 與熒光檢測器連用；HPLC 與免疫血清學(xué)連用； (4)轉(zhuǎn)換產(chǎn)物包括子離子和次級子離子產(chǎn)物。表6 質(zhì)譜技術(shù)和連用技術(shù)獲得識別點(diǎn)數(shù)的例子(n一個(gè)整數(shù))技術(shù)離子數(shù)鑒別點(diǎn)數(shù)LC-MSNNLC-MS-MS1個(gè)母離子十2 個(gè)子離子4LC-MS-MS2個(gè)母離子，每個(gè)有1個(gè)子離子5LC-MS-MS-MS1 個(gè)母離子，1 個(gè)子離子，2 個(gè)次級子離子5.5HRMSN2N2.3.4 使用其他檢測技術(shù)的液相測定分析物

24、的性能標(biāo)準(zhǔn)和其他要求。2.3.4.1 色譜分離如果可以獲得用于這一目的的一種物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)該盡可能的使用。如果相關(guān)物的保留時(shí)間與分析物的保留時(shí)間接近，則是更合適的。相同實(shí)驗(yàn)條件下，分析物在相應(yīng)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品典型的保留時(shí)間下被洗脫。分析物最小可接受的保留時(shí)間是2倍的色譜柱死體積相應(yīng)的保留時(shí)間。分析物和內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間的比值，即分析物的相對保留時(shí)間，應(yīng)該與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的比值在合適的范圍內(nèi)相同，允許±2.5誤差。2.3.4.2 全掃描UVVIS 檢測液相方法的性能標(biāo)準(zhǔn)必須達(dá)到。分析物光譜最大吸收波長應(yīng)該與在檢測系統(tǒng)分辨率測定誤差范圍內(nèi)的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長相同。對二極管點(diǎn)陣檢測器，允許誤差值

25、為±2nm。對于220nm 以上的分析物，具有相對吸收系數(shù)10的兩個(gè)光譜部分，其光譜應(yīng)該與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品光譜沒有顯而易見的區(qū)別。首先存在相同的最大吸收，其次兩個(gè)光譜中在與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品吸收系數(shù)10部分沒有觀察到區(qū)別，即為符合標(biāo)準(zhǔn)。如果使用計(jì)算機(jī)幫助的圖庫搜尋和匹配，測試樣品的光譜數(shù)據(jù)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品光譜數(shù)據(jù)比較必須超過標(biāo)準(zhǔn)匹配因子。該因子在分析物己完成以上描述標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)的光譜確證過程期間被測定。樣品基質(zhì)和檢測器性能引起的變異應(yīng)該被檢查。2.3.4.3 熒光檢測的性能標(biāo)準(zhǔn)液相方法的性能標(biāo)準(zhǔn)必須達(dá)到。該方法將應(yīng)用于顯示自身熒光的分子和在轉(zhuǎn)化或衍生后顯示熒光的分子。結(jié)合色譜條件的激發(fā)和吸收波長的選擇應(yīng)

26、該以在空白樣品中發(fā)生干擾組分減少到最小的方式完成。色譜條件下最近的峰的極大處應(yīng)該與指定分析物的峰分離，至少為完整的分析物峰的最大高度10的一個(gè)全峰峰寬。2.3.4.4 使用帶UV/VIS 檢測(單波長)的LC測定分析物帶UV/VIS 檢測(單波長)的LC 方法本身作為確證方法使用是不適當(dāng)?shù)?。色譜條件下最近的峰的極大處應(yīng)該與指定的分析物的峰分離，至少為完整的分析物的峰的最大高度10的一個(gè)全峰寬度。3確證確證將證明分析方法應(yīng)遵照標(biāo)準(zhǔn)中可適用的相關(guān)的性能特征。不同的檢查目的要求不同的方法種類。下表確定了方法類型檢驗(yàn)的性能特征。表7 分析方法通過已確定了的性能特征的分類方法檢測容量CC決定限度CC真實(shí)

27、度/回收率精密度選擇性/特異性實(shí)用性/耐用性/穩(wěn)定性定性S+-+方法C+-+定量S+-+方法C+注：S篩選法；C確認(rèn)方法；十必需測定的31 確證程序本章為分析方法的確證程序提供了例證和或參考資料。其他證明分析方法符合需要使用性能標(biāo)準(zhǔn)的性能標(biāo)準(zhǔn)的方法，只要他們達(dá)到同樣的水平和同質(zhì)的信息。確證也能通過進(jìn)行如食品法典，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)或國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)確定的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)來完成，或根據(jù)替代方法如單個(gè)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)或內(nèi)部確證。本部分集中關(guān)注使用模型方法的單個(gè)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(內(nèi)部確證)。這個(gè)方法由以下部分組成：(a)一套獨(dú)立于所用確證模型的共同性能特征； (b)在表8 中所描述的更具

28、體的模型決定程序。表 8 獨(dú)立模式和相關(guān)模式的性能參數(shù)（確證）獨(dú)立模式性能參數(shù)相關(guān)模式性能參數(shù)共同性能參數(shù)（3.1.1）傳統(tǒng)確證方法（3.1.2）內(nèi)部確證方法（3.1.3）特異性回收率回收率真實(shí)性重復(fù)性重復(fù)性耐用性：微小變化室內(nèi)重現(xiàn)性室內(nèi)重現(xiàn)性穩(wěn)定性重現(xiàn)性重現(xiàn)性定量限(CC)定量限(CC)檢測限(CC)檢測限(CC)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線耐用性：主要變化耐用性3.1.1 獨(dú)立模型性能標(biāo)準(zhǔn)無論選擇那種確證方法，下面的性能特性必須確定。為減少工作負(fù)荷量，可以采用仔細(xì)設(shè)計(jì)并具有統(tǒng)計(jì)意義的方法將測定不同參數(shù)的試驗(yàn)合并進(jìn)行。3.1.1.1 特異性對于分析方法，分析物和接近的相關(guān)物質(zhì)(同分異構(gòu)體、代謝物、降解物

29、、內(nèi)源性物質(zhì)、基質(zhì)組成成分等)之間的鑒別能力是重要的。必須有兩種方法檢查干擾情況。因此，應(yīng)選出潛在的干擾物質(zhì)，并且有關(guān)的空白樣品應(yīng)經(jīng)分析，以檢測可能存在的干擾和估計(jì)干擾的影響：選擇一系列化學(xué)相關(guān)的化合物(代謝物、衍生物等)或其他可能在樣品中存在影響的、可能遇到的物質(zhì)；分析適當(dāng)數(shù)量的有代表性的空白樣品(n20)，檢查在期望目標(biāo)分析物被洗脫的影響區(qū)域內(nèi)的任何干擾(信號、峰、離子蹤跡)；此外，有代表性的空白樣品應(yīng)添加相關(guān)濃度的可能干擾分析物的鑒別和/或定量的有關(guān)物質(zhì)；分析以后，檢查是否：(a)存在的干擾可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定；(b)目標(biāo)分析物的鑒定被一個(gè)或多個(gè)干擾所阻礙：或(c)定量分析顯著地受到影響。

30、3.1.1.2 真實(shí)性在本節(jié)，定量的真實(shí)性(準(zhǔn)確度的一個(gè)組分)被描述。真實(shí)性只能通過用認(rèn)證的基準(zhǔn)物質(zhì)(CRM)來確認(rèn)?；鶞?zhǔn)物質(zhì)只要可得到就應(yīng)使用。該程序在ISO 57254(5)中被詳細(xì)描述。舉例如下：按照方法測試指南分析六份基準(zhǔn)物質(zhì)的重復(fù)樣品；測定存在于每份重復(fù)樣品中分析物的濃度；計(jì)算這些濃度值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)()；通過將測定的濃度平均值除以核準(zhǔn)值(測定濃度)再乘以100 計(jì)算真實(shí)性，結(jié)果用百分?jǐn)?shù)表示。真實(shí)性()檢測的平均回收校正濃度×100核準(zhǔn)值如果得不到基準(zhǔn)物質(zhì)，用4.1.2.1 項(xiàng)下的描述測定回收率代替準(zhǔn)確性。3.1.1.3 實(shí)用性/耐用性(較小的變化)這樣的研究

31、通過實(shí)驗(yàn)室故意引入較小的合理的變化和觀察它們的后果進(jìn)行。預(yù)調(diào)查研究必須通過選擇可能影響測定結(jié)果的樣品的預(yù)處理、凈化和分析因素進(jìn)行。這樣的因素可能包括分析員、試劑的來源和年限、溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取物、加熱速度、溫度、pH 值和許多其他可能在實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)的因素。這些因素應(yīng)用在不同實(shí)驗(yàn)室之間通常遇到的偏差比較得出的數(shù)量級進(jìn)行校正；鑒別能影響結(jié)果的可能因素；輕微地改變每一因素；用Youden的方法實(shí)施耐用性試驗(yàn)。(在這點(diǎn)上其他的方法也可使用。但是Youden方法使要求的時(shí)間和努力最小。Youd方法是一種部分因素的設(shè)計(jì)。不同因素間的相互作用不能被檢測出；一旦發(fā)現(xiàn)有因素對測定結(jié)果產(chǎn)生重大影響，要實(shí)施進(jìn)一步

32、的實(shí)驗(yàn)以確定這一因素可接受的限度；對結(jié)果有重大影響的因素應(yīng)在方法草案中清楚地表示出來?；镜母拍畈皇且淮窝芯恳粋€(gè)改變而是一次引入兩三個(gè)變化。例如，讓A、B、C、D、E、F、G 表示七個(gè)不同的能影響結(jié)果因素的名義上的值，如果它們名義上的值輕微變化，用相應(yīng)的小寫字母a、b、c、d、e、f 和g 表示它們的替換值。這樣結(jié)果有27或128 種不同的可能的組合。在這些組合中，可以選擇一個(gè)有八種組合的大小寫字母平衡分配的子集(表9)。必須進(jìn)行八次測定，每次采用選擇的因素的一種組合(AG)。測定的結(jié)果在表9 中顯示為SZ。表9 耐用性研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)(較小的變化)因素值測定數(shù)字的組合F12345678A/aAA

33、AAaaaaB/bBBBbBBbbC/cCCCcCcCcD/dDDddddDDE/eEeEeeEeEF/fFffFFffFG/gGggGgGGg觀察的結(jié)果RSTUVWXYZ3.1.1.4 穩(wěn)定性已經(jīng)觀察到樣品中分析物或基質(zhì)組成成分在保存或分析過程中不十分穩(wěn)定可能引起分析結(jié)果中出現(xiàn)嚴(yán)重偏差。此外，應(yīng)檢查校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品在溶液中的穩(wěn)定性。通常分析物在不同的貯存條件下的穩(wěn)定性被很好地描述。保存條件的監(jiān)測將構(gòu)成常規(guī)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可系統(tǒng)的一部分。當(dāng)這些不知道時(shí)，下面舉例說明如何測定穩(wěn)定性。溶液中分析物的穩(wěn)定性：制備新鮮分析物儲(chǔ)備液，并按試驗(yàn)指南稀釋以獲得足夠份數(shù)(例如40)的指定濃度的溶液(未建立允許限量的物質(zhì)，為

34、最小要求性能限度，其他物質(zhì)圍繞允許的限度)。準(zhǔn)備兩種分析物溶液，一種作為添加的溶液，一種作為最終的分析溶液，以及其他感興趣的溶液(例如衍生的標(biāo)準(zhǔn)品)。依據(jù)試驗(yàn)指南測定分析物在新鮮制備的溶液中的含量。分裝適宜的體積至合適的容器中，貼標(biāo)簽并根據(jù)計(jì)劃保存：表10 分析物在溶液中穩(wěn)定性測定計(jì)劃保存條件20十 4十 20暗處10 等份試樣10 等份試樣10 等份試樣亮處10 等份試樣保存時(shí)間可以選擇為1、2、3、4 星期或根據(jù)需要選擇更長時(shí)間，必要時(shí)直到在鑒別和或定量試驗(yàn)中觀察到第一次降解現(xiàn)象。要記錄最長保存時(shí)間和最佳保存條件。每一等份分試樣中分析物濃度的計(jì)算應(yīng)以新鮮制備的分析物溶液的濃度為100進(jìn)行。

35、剩余的分析物()Ci×l00C新鮮式中：Ci某一時(shí)間點(diǎn)的濃度；C新鮮新鮮溶液的濃度?；|(zhì)中分析物的穩(wěn)定性：只要可能，應(yīng)選用實(shí)際的樣品。得不到實(shí)際的樣品時(shí)，應(yīng)用添加分析物的基質(zhì)。當(dāng)可以得到實(shí)際的材料時(shí)，材料的濃度應(yīng)在新鮮配制時(shí)測定。材料進(jìn)一步等份分樣品可以在1、2、4 和20 周后取并測定濃度。組織應(yīng)至少儲(chǔ)存在20以下或根據(jù)要求采用更低的溫度。如果得不到實(shí)際的材料，取一些空白材料并混合均勻。將材料分為5 等份樣品，每份樣品中添加分析物，分析物最好制備于少量水溶液中，立即分析一份樣品。儲(chǔ)存剩余的樣品于至少在20以下或根據(jù)要求采用更低的溫度，并于1、2、4 和20 周后分析。3.1.1.5

36、 校準(zhǔn)曲線當(dāng)校準(zhǔn)曲線用于定量時(shí)：至少有五個(gè)水平(包括零)用于繪制曲線；要描述曲線的工作范圍；要描述曲線的數(shù)學(xué)公式和數(shù)據(jù)對曲線的吻合情況；要描述曲線可接受的參數(shù)范圍。當(dāng)必須進(jìn)行基于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的一系列校準(zhǔn)時(shí)，要指出校準(zhǔn)曲線參數(shù)可接受的范圍，該范圍可以在不同的系列變化。對于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.98，對于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。測試溶液中被測組分濃度必須在校準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。3.1.2 傳統(tǒng)的確證程序依據(jù)傳統(tǒng)的方法計(jì)算參數(shù)要求有幾個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)工作。每一工作特性由每一主要變化決定(見上述的實(shí)用性/耐用性項(xiàng)下)。對于多組分分析方法，只要先前可能的有關(guān)干擾能被排除，幾

37、個(gè)分析物可以被同時(shí)分析。幾個(gè)工作特性可以被一個(gè)相似的方法確定。所以，為減少工作量，建議可能的情況下組合試驗(yàn)(例如，重現(xiàn)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的特異性檢測的重現(xiàn)性，確定決定限的空白樣品分析和特異性檢測的試驗(yàn))。3.1.2.1 回收率如果沒有認(rèn)證過的基準(zhǔn)物質(zhì)，回收率必須通過空白添加試驗(yàn)確定，舉例如下：選擇18 等份空白樣品，分別以1、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允許限量添加到6 等份樣品；分析樣品并且計(jì)算每份樣品的濃度；用下列方程式，計(jì)算每份樣品的回收率；計(jì)算平均回收率和每一添加水平6 個(gè)結(jié)果的CV；回收率()100×測定含量添加濃度水平。這個(gè)測定回收率的常規(guī)方法是在3.

38、5 中描述的標(biāo)準(zhǔn)附加方法的變種，用于：樣品被認(rèn)為是用空白樣品而非要分析的樣品；試驗(yàn)樣品有相同的質(zhì)量和試驗(yàn)部分提取物有相同的體積；加入到第二(添加)試驗(yàn)部分的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量記為XADD(XADDA·VA)；X1 是空白的測定值、X2 是第二(添加)試驗(yàn)部分測定值；然后,回收率()100(X2X1)XADD。當(dāng)沒有得到任何上述條件(或假定)，那就意味著測定回收率的程序不得不完全執(zhí)行3.5中描述的標(biāo)準(zhǔn)附加方法。3.1.2.2 重復(fù)性制備一系列同一基質(zhì)的樣品，添加分析物使?jié)舛葹?、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允許限量；每一水平的分析應(yīng)至少重復(fù)6 次；分析樣品；計(jì)算

39、每份樣品的測定濃度，求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和添加樣品的變異系數(shù)()；至少在兩個(gè)其他條件下重復(fù)這些步驟：計(jì)算所有的平均濃度和添加樣品的CVs。3.1.2.3.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重現(xiàn)性制備一系列指定試驗(yàn)物質(zhì)(同一的或不同的基質(zhì))的樣品，添加分析物使?jié)舛葹?、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允許限量：每一水平的分析應(yīng)至少重復(fù)6 次；由不同的操作者在不同的環(huán)境中至少兩次重復(fù)這些步驟，如不同批次的試劑、溶劑等，不同的室溫，不同的儀器等，如果可能的話；分析樣品：計(jì)算每份樣品的測定濃度：求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和添加樣品的變異系數(shù)()。3.1.2.4 重現(xiàn)性當(dāng)重現(xiàn)性需要驗(yàn)證時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)依據(jù)ISO

40、57252(5)參與合作研究。3.1.2.5 確定限(CC)確定限要依據(jù)“分析方法的工作標(biāo)準(zhǔn)和其他要求”(第2 部分)中關(guān)于鑒別或鑒別加定量定義的要求確定。如果該物質(zhì)的允許限度還沒有建立，則按照下列方法確定CC：要么按照ISO11843(17)采用校準(zhǔn)曲線方法(這里指的是凈狀態(tài)變量的臨界值)。在這種情況下，應(yīng)使用空白物質(zhì)，按照等距離梯度添加物質(zhì)，使之等于和高于反應(yīng)所需的最低量。分析樣品。鑒定后，根據(jù)添加的物質(zhì)濃度繪圖。Y 軸上的相應(yīng)濃度加實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)差的2.33 倍，即等于決定限度。這種方法僅適用于定量檢測(1)：或通過分析每種矩陣至少20個(gè)空白物質(zhì)，以便能夠計(jì)算預(yù)期存在分析物的時(shí)間

41、窗口中信號與噪音比。可以將信號嗓音比的3 倍作為決定限度。這種方法適用于定性和定量檢測。如果該物質(zhì)的允許限度已經(jīng)建立，則按照下列方法確定CC：要么按照ISO11843(17)采用校準(zhǔn)曲線方法(這里指的是凈狀態(tài)變量的臨界值)。在這種情況下，應(yīng)使用空白物質(zhì)，按照等距離梯度添加物質(zhì)，使之位于允許限度周圍。分析樣品。鑒定后，根據(jù)添加的物質(zhì)濃度繪圖。處于允許限度時(shí)的相應(yīng)濃度加實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)差的1.64 倍，即等于決定限度(5)；或通過分析每種矩陣至少20 個(gè)添加了允許限度的分析物的空白物質(zhì)。處于允許限度時(shí)的濃度加相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差的1.64 倍，即等于決定限度(5)。也可見第5 款和3.2。3.1.2.

42、6 檢測容量(CC)應(yīng)根據(jù)所定義的(見第2 部分)篩選、鑒別或鑒別加定量的要求確定檢測容量。如果該物質(zhì)的允許限度還沒有建立，則按照下列方法確定cc：按照ISO11843(17)采用校準(zhǔn)曲線方法(這里指的是凈狀態(tài)變量的最低可檢測值)。在這種情況下，應(yīng)使用有代表性的空白物質(zhì)，按照等距離梯度添加物質(zhì)，使等于和低于反應(yīng)所需的最低量。分析樣品。鑒定后，根據(jù)添加的物質(zhì)濃度繪圖。決定限度時(shí)的相應(yīng)濃度加決定限度時(shí)的平均檢測含量的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的1.64 倍，即等于檢測容量(5)；分析每種矩陣至少20 個(gè)添加有決定限度水平的分析物的空白物質(zhì)。分析樣品，對分析物進(jìn)行鑒別。決定限度值加檢測含量的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重

43、現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的1.64 倍，即等于檢測容量(5)；在不能獲得定量結(jié)果時(shí)，可以通過對添加量大于或等于決定限度的空白物質(zhì)進(jìn)行研究來確定檢測容量。在這種情況下，僅僅保留5錯(cuò)誤的順應(yīng)的結(jié)果，濃度水平等于該方法的檢測容量。因此，為了保證該檢測具有可靠的基礎(chǔ)，應(yīng)至少對一個(gè)濃度水平進(jìn)行至少20 個(gè)次檢測。如果該物質(zhì)的允許限度已經(jīng)建立，則按照下列方法確定CC：要么按照ISO 11843(17)采用校準(zhǔn)曲線方法(這里指的是凈狀態(tài)變量的最低可檢測值)。在這種情況下，應(yīng)使用有代表性的空白物質(zhì)，按照等距離梯度添加物質(zhì)，使之位于允許限度周圍。分析樣品并鑒定分析物。計(jì)算決定限度時(shí)的平均檢測含量的標(biāo)準(zhǔn)差。決定限度時(shí)的相應(yīng)濃度加實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的1.64 倍，即等于檢測容量(5)；或通過分析每種矩