保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測膠體金免疫層析法(KJ201901)

1、附件1保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201901）i范圍本方法規(guī)定了保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的膠體金免疫層析快速篩查方法。本方法適用于聲稱具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等功能的保健食品中西地那非和他達(dá)拉非成分的快 速篩查。2原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的西地那非和他達(dá)拉非等物質(zhì)經(jīng)提取后與膠體金 標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中西地那非和他達(dá)拉非成分進行定性判定。3試劑材料3.1 試劑除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

2、 6682規(guī)定的二級水。3.1.1 甲醇：色譜純。3.1.2 三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。3.1.3 濃鹽酸。3.1.4 吐溫-20。3.1.5 鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀釋至 100 mL。3.1.6 緩沖液：稱取12.1 g Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調(diào)節(jié)pH至8.0，加入5.0 g吐溫-20（ 3.1.4）攪拌均勻，定容至 1000 mL。3.2 參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1,純度均99%。表1參考物質(zhì)信息表序號中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量序號

3、中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量1西地那非Sildenafil139755-83-2C22H 30N6O4S474.582他達(dá)拉非Tadalafil171596-29-5C22H19N3O4389.40注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1 西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL ）:精密稱取適量西地那非參考物質(zhì) （3.2）,用甲醇（3.1.1） 溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20 C避光保存，有效期1年。3.3.2 西地那非標(biāo)準(zhǔn)工作液（10卩g/mL）：精密移取適量西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲備液 （1.0 mg/mL）（ 3.3.1） 分

4、別置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為 10卩g/mL的標(biāo)準(zhǔn) 工作液。-20 C避光保存，有效期 3個月。3.3.3 他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲備液（0.5 mg/mL ）:精密稱取適量他達(dá)拉非參考物質(zhì) （3.2）,用甲醇（3.1.1） 溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20 C避光保存，有效期1年。3.3.4 他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)工作液 （10卩g/mL）:精密移取適量他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲備液 （0.5mg/mL ） （3.3.3） 分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 10卩g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工 作液。-2

5、0C避光保存，有效期 3個月。3.4 材料西地那非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 他達(dá)拉非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。4設(shè)備與儀器4.1 設(shè)備4.1.1 天平：感量為 0.1 mg和0.01 g。4.1.2 渦旋混合器。4.1.3 移液器：20-200 X, 100-1000 譏，5 mL。4.1.4 離心機：轉(zhuǎn)速可達(dá) 4000 r/min以上。4.2 儀器4.2.1 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測儀器（可選）。4.2.2 環(huán)境條件：溫度 10-40 C,相對濕度W 80%。5分析步驟5.1 試樣制備液體樣品充分混勻，固體樣品充分

6、粉碎混勻。5.2 試樣提取和凈化5.2.1 液體基質(zhì)量取 0.5 mL±0.02 mL 試樣于 15 mL 離心管中，加入 4 mL 緩沖液（ 3.1.6），渦旋混合 30 s， 作為待測液。5.2.2 固體基質(zhì)5.2.2.1 檢測西地那非準(zhǔn)確稱取試樣 0.5 g ±0.01 g 于 15 mL 離心管中，加 1 mL 甲醇（ 3.1.1），渦旋 30 s，4000 rpm 離心2 min或靜置2 min。取250丄上清液于2 mL離心管中，加入 750山緩沖液（3.1.6），渦 旋混合30s,作為待測液。5.2.2.2 檢測他達(dá)拉非準(zhǔn)確稱取試樣 0.5 g ±0

7、1 g于15 mL離心管中，加 1 mL甲醇（3.1.1），渦旋 30 s，4000 rpm 離心2 min或靜置2 min。取200丄上清液于15 mL離心管中，加入 3 mL緩沖液（3.1.6），渦旋 混合30 s,作為待測液。注：試樣提取和凈化（ 5.2 ）過程可按照試劑盒說明書操作，不做限定。5.3 測定步驟5.3.1 試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟吸取200 L樣品待測液于金標(biāo)微孔中， 抽吸510次使混合均勻，室溫溫育5 min ;溫育結(jié)束 后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，室溫溫育5 min，從微孔中取出試紙條， 去掉試紙條下端的吸水海綿，進行結(jié)果判定。注：測定步驟建議按照試

8、劑盒說明書。5.3.2 檢測卡與金標(biāo)微孔測定步驟吸取200卩1上述待測液于金標(biāo)微孔中， 上下抽吸510次使混合均勻。室溫溫育5 min，將反 應(yīng)液全部加入到檢測卡的加樣孔中，將金標(biāo)微孔中全部溶液滴加到檢測卡上的加樣孔中，溫育5min ，進行結(jié)果判定。注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。5.4 質(zhì)控試驗每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗。5.4.1 空白試驗準(zhǔn)確稱取固體空白試樣 0.5 g ±01 g或量取液體空白試樣 0.5 mL ±0.02 mL于15 mL離心管中， 按照 5.2 和 5.3步驟與試樣同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗準(zhǔn)確稱取固體空白試樣 0.5 g

9、 ±01 g或量取液體空白試樣 0.5 mL ±0.02 mL于15 mL離心管中， 加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液 （3.3.2），使西地那非參考物質(zhì)濃度為1.0 g/g或1.0 g/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。準(zhǔn)確稱取固體空白試樣 0.5 g ±01 g或液體空白試樣 0.5 mL ±）.02 mL于15 mL離心管中，加 入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.4），使他達(dá)拉非參考物質(zhì)濃度為1.0 gg/g或1.0 gg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。6 結(jié)果判定通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1

10、。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。6.1 無效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。6.2 陰性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測線（T線）顏色與控 制線（C線）顏色相當(dāng)，均表示樣品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。6.3 陽性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測線（T線）不顯 色，均表示樣品中待測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。6.4 質(zhì)控試驗要求空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對結(jié)果進行確證。性能指標(biāo)8.1檢出限固體樣品1.0卩g/g液體樣品

11、1.0卩g/mL>8.2靈敏度靈敏度95%。8.3 特異性特異性90%。8.4 假陰性率假陰性率w 5%。8.5 假陽性率假陽性率w 10%。注： 性能指標(biāo)計算方法見附錄 A。9 其他本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定 的性能指標(biāo)。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做 限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品補充檢驗方法BJS201710保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測藥品檢驗補充檢驗方法 2009030補腎壯陽類中成藥中 PDE-5型

12、抑制劑的快速檢測方法。本方法使用西地那非試劑盒可能與那莫西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、偽伐 地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反應(yīng)；他達(dá)拉非試劑盒可能與氨基他達(dá)拉非、去甲基 他達(dá)拉非存在交叉反應(yīng)；當(dāng)結(jié)果判定為陽性應(yīng)對結(jié)果進行確證。附錄A定性方法性能指標(biāo)計算表表A.1性能指標(biāo)計算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2顯著性差異（乎）F=（ |N12-N21 -1）2/（ N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（P+，%）p+=N11/N1.特異性（P-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+-N21/N2=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/（N1.+N2.）注：a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用