質(zhì)粒圖譜大全

1、轉(zhuǎn)載Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbApTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS()L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40bProteinExpression

2、?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCellsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDN

3、AProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKitsTEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12pCDNA3.1(-)pCDNA3.1()pPICZalphaApGAPZApBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9K如何閱讀分析質(zhì)粒圖譜載體主要

4、有病毒和非病毒兩大類，其中質(zhì)粒DNA一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一、一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素復(fù)制起始位點(diǎn)Ori?即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)?？股乜剐曰蚩梢员阌诩右詸z測(cè)，如Amp ?,Kan多？克隆位點(diǎn)MC魏隆攜帶外源基因片段P/E?啟動(dòng)子/增強(qiáng)子Terms終止信號(hào)？加polyA信號(hào)？可以起到穩(wěn)定 mRN肝用二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜第一步：首先看 Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型原核 /真核/穿梭質(zhì)粒第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。1Ampr水解3內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芳的毒性。2tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。3cam

5、r生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。4neor kanr氨基糖昔磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418長(zhǎng)那霉素衍生物失活5hygr使潮霉素3失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)MCS。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA由入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNM段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一

6、些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子促進(jìn) DNA轉(zhuǎn)錄的DNAI順序，這個(gè)DNAK域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA子上可以與 RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。？增強(qiáng)子/沉默子-為真核？基因組包括真核病毒基因組中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子一負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列Rbs/AGU/SDs： mRNAt核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是A

7、UG起始密碼和 SD序列。？轉(zhuǎn)錄終止順序終止子/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn) down- stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成polyA力口 尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn) down- stream有一段GM T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成polyA加尾彳t號(hào)。？答復(fù)有人之前提出的一個(gè)問(wèn)題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基 因在另一條鏈上.三、介紹一下關(guān)于載體的知識(shí)雖然課本上都有寫(xiě)1 .什么是

8、載體即要把一個(gè)有用的基因目的基因一一研究或應(yīng)用基因通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞 受體細(xì)胞，需要運(yùn)載工具交通工具攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載 體vector。P.S.基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA2 .載體的分類按功能分成：1克隆載體都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中 復(fù)制擴(kuò)增。它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增 DNA片段基因的載體。所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下， 要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體2表達(dá)載體具有克隆載體的基本元件ori,Ampr,Mcs等還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：1原核載

9、體2真核載體3穿梭載體sbuttlevector 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子， 因而可以運(yùn)載目的基因穿梭往返兩種生物之間. P.S.穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物 2個(gè)復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。3 .基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)：一都能獨(dú)立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS插在其中的外源 DNM段，能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。二都能便利的加以檢測(cè)：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放 在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。三都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞

10、中別離純化出來(lái)。4 .載體的選擇和制備：選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述 3點(diǎn)：【1】構(gòu)建DNAM組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體 /表達(dá)載體。【2】.載體的類型：1克隆載體的克隆能力據(jù)克隆片段大小大選大，小選小。如10kb選質(zhì)粒。2表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。3對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3點(diǎn)：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌；用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。【3】載體MC計(jì)的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。選用質(zhì)粒最常用做載體的4點(diǎn)要求：選分子量小的質(zhì)粒，即小載體不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多也