基因工程制藥

1、微生物基因工程制藥一、基因工程建立的基礎(chǔ)2. DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理的建立雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理的建立 19531953年，沃森年，沃森(Watson(Watson） 和克里克和克里克 （CrickCrick） 首次提出首次提出了了DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。這一重大發(fā)現(xiàn)大大雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。這一重大發(fā)現(xiàn)大大地促進(jìn)了現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展。地促進(jìn)了現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展。3.3.遺傳信息傳遞方式的確立遺傳信息傳遞方式的確立（二）、技術(shù)上三個重要成果（二）、技術(shù)上三個重要成果1.1.基因工程的工具酶基因工程的工具酶2.2.基因工程載體基因工程載體為了使為了使DN

2、ADNA片段能在宿主細(xì)胞中得以擴(kuò)增，須將其接到一個特片段能在宿主細(xì)胞中得以擴(kuò)增，須將其接到一個特定能夠進(jìn)行自我復(fù)制的載體分子上。定能夠進(jìn)行自我復(fù)制的載體分子上。LederbergLederberg開始從事細(xì)菌開始從事細(xì)菌性因子（性因子（F F因子）研究。因子）研究。2020世紀(jì)世紀(jì)50-6050-60年代，相繼發(fā)現(xiàn)其他質(zhì)粒，年代，相繼發(fā)現(xiàn)其他質(zhì)粒，如抗藥性基因（如抗藥性基因（R R因子）和大腸桿菌因子（因子）和大腸桿菌因子（CoECoE）。這些工作為）。這些工作為基因工程載體系統(tǒng)的建立打下基礎(chǔ)?；蚬こ梯d體系統(tǒng)的建立打下基礎(chǔ)。3.3.基因的體外重組技術(shù)基因的體外重組技術(shù)19731973年，年，

3、科恩（科恩（CohenCohen）等人用等人用EcoR IEcoR I內(nèi)切酶處理內(nèi)切酶處理大腸桿菌的抗四環(huán)素和抗大腸桿菌的抗四環(huán)素和抗青霉素及磺胺的質(zhì)粒，并青霉素及磺胺的質(zhì)粒，并連接成一個新的重組質(zhì)粒。連接成一個新的重組質(zhì)粒。將這種工程化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入將這種工程化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在含有四環(huán)素大腸桿菌，在含有四環(huán)素和青霉素的平板中篩選重和青霉素的平板中篩選重組菌落。組菌落。同年，加利福尼亞的同年，加利福尼亞的博耶博耶（BoyerBoyer）也進(jìn)行了類似也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。的實(shí)驗(yàn)。重組子轉(zhuǎn)化的成功標(biāo)志著重組子轉(zhuǎn)化的成功標(biāo)志著基因工程的誕生基因工程的誕生。 （三）、基因工程的研究內(nèi)容（三）、基因工程

4、的研究內(nèi)容二、基因工程相關(guān)概念及基本工具（一）、基因工程的相關(guān)概念（一）、基因工程的相關(guān)概念3.3.目的基因目的基因 有時應(yīng)用重組有時應(yīng)用重組DNADNA技術(shù)的分離、獲得某一感興趣的基因或技術(shù)的分離、獲得某一感興趣的基因或DNADNA序列，有時是為獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物序列，有時是為獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。4.4.基因載體基因載體 也稱克隆載體。這是為也稱克隆載體。這是為“攜帶攜帶”感興趣的外源感興趣的外源DNADNA、實(shí)現(xiàn)、實(shí)現(xiàn)外源外源DNADNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNADNA分子。其中，為使插入的外源分子

5、。其中，為使插入的外源DNADNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計的克隆載體又稱表達(dá)載體?？沙洚?dāng)克隆譯成多肽鏈而設(shè)計的克隆載體又稱表達(dá)載體?？沙洚?dāng)克隆載體的載體的DNADNA分子有質(zhì)粒分子有質(zhì)粒DNADNA、噬菌體、噬菌體DNADNA和病毒和病毒DNADNA。分子剪刀和分子針線分子剪刀和分子針線（二）、基因工程的工具酶（二）、基因工程的工具酶1.1.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)(restriction endonuclease, RE)(1) (1) 定義定義是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別和是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能

6、專一識別和切割雙鏈切割雙鏈DNA中的特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶，簡稱中的特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HHu與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制限制- -修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng)：限：限制外源制外源DNADNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNADNA，穩(wěn)定細(xì)菌遺傳性狀。，穩(wěn)定細(xì)菌遺傳性狀。u、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）EcoR 屬屬 種種 株株 序序Escherichia coli RY13株株大腸桿菌大腸桿菌 RY13株的第

7、一種酶株的第一種酶 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 特異識別及切割特異識別及切割4 4 8 8個個bpbp長度且具有回文序列的長度且具有回文序列的DNADNA片斷，主要產(chǎn)生片斷，主要產(chǎn)生3 3種末端結(jié)構(gòu)：種末端結(jié)構(gòu)： 5 5粘性末端粘性末端 3 3粘性末端粘性末端 平端或鈍端平端或鈍端 回文序列回文序列(palindrome)(palindrome) 是指該部位的核苷酸序列呈是指該部位的核苷酸序列呈180180O O反向重復(fù)反向重復(fù); ; 粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end) 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5 5末端突出和末端突出

8、和3 3末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性。Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口 同尾酶同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCT

9、AG GATCT A2. DNA2. DNA聚合酶聚合酶 （全酶）（全酶） 3.TaqDNA3.TaqDNA聚合酶聚合酶 (TaqDNA polymerase)4.4.逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶6. DNA連接酶連接酶(DNA ligase) 催化雙鏈催化雙鏈DNADNA中一條鏈的中一條鏈的3-OH與另一條鏈的與另一條鏈的5-PO3H2形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)成完整的形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)成完整的DNADNA長鏈。長鏈。 DNADNA連接酶的用途連接酶的用途（1 1） 兩個雙鏈兩個雙鏈DNADNA片段連接起來片段連接起來5- ACG AATTCGT-3 5- ACG AATTCGT-3 T T4 4DNA

10、DNA連接酶連接酶 5-ACGAATTCGT-35-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2） 修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNADNA分子分子T4DNA連接連接酶酶7.堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 8.末端末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT) 作用作用 將標(biāo)記或未標(biāo)記的將標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的3 3-OH-OH末端；也可催化末端；也可催化載體分子或待克隆的載體分子或待克隆的DNAD

11、NA片段上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一片段上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一步連接。步連接。應(yīng)用應(yīng)用 探針標(biāo)記探針標(biāo)記 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接3 3 3 3 （型）型）（三）、基因工程的載體（三）、基因工程的載體來源分類來源分類：質(zhì)粒載體：質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體病毒載體病毒載體人工染色體載體人工染色體載體用途分類用途分類：克隆載體：克隆載體表達(dá)載體表達(dá)載體 穿梭載體穿梭載體克隆載體克隆載體(cloning vector)能使插入的外源能使插入的外源DN

12、A序列被復(fù)制、擴(kuò)增序列被復(fù)制、擴(kuò)增而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體。而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 使插入的外源使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)出多肽鏈，這樣的載體稱為表達(dá)載體。出多肽鏈，這樣的載體稱為表達(dá)載體。這類載體中含有來源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，既具這類載體中含有來源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，既具備備原核細(xì)胞原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在片段在真核細(xì)胞真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因標(biāo)記基因,故能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，克

13、隆故能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector)具有能使外源具有能使外源DNADNA片段組入的克隆位點(diǎn)。片段組入的克隆位點(diǎn)。能攜帶外源能攜帶外源DNADNA進(jìn)入受體細(xì)胞，或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我進(jìn)入受體細(xì)胞，或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體復(fù)制，或整合到染色體DNADNA上隨染色體上隨染色體DNADNA的復(fù)制而復(fù)制。的復(fù)制而復(fù)制。必須具有選擇標(biāo)記，承載外源必須具有選擇標(biāo)記，承載外源DNADNA的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，的

14、載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，以便篩選克隆子。以便篩選克隆子。分子量小，拷貝數(shù)高。分子量小，拷貝數(shù)高。具有較高的遺傳穩(wěn)定性。具有較高的遺傳穩(wěn)定性。基因克隆載體必須具備三個條件基因克隆載體必須具備三個條件具有具有復(fù)制子復(fù)制子，篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記，位于多克隆位，位于多克隆位點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子啟動子，起始密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終轉(zhuǎn)錄終止子止子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：三、基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物 傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì)和多肽類，包括：（1）免疫蛋白質(zhì)免疫蛋白質(zhì)-各種抗原、單克隆抗體、乙肝疫苗。（2）細(xì)

15、胞因子細(xì)胞因子-各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長因子、表皮生長因子、凝血因子、促紅細(xì)胞生成素。（3）激素-胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素。（4）酶類-尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。 四、基因工程制藥的優(yōu)點(diǎn)（1）利用基因工程技術(shù)可以生產(chǎn)出過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以通過大批量大批量的生產(chǎn)方法獲得足夠數(shù)量的生物活性物質(zhì)。（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)掘出更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。（4）利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以對藥物蛋白進(jìn)行修飾和改造修飾和改造，來提高藥效價值和獲得新型的化合物。

16、五、基因工程制藥所使用的生物技術(shù)（1 1）DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)（2 2）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)（3 3）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（4 4）克隆表達(dá)技術(shù)）克隆表達(dá)技術(shù)六、我國基因工程制藥的進(jìn)展 -1b-1b型基因工程干擾素型基因工程干擾素，是我國自行研究開發(fā)的具有國際先進(jìn)水平的基因工程藥物，于1997年通過III期臨床，并獲得國家一類新藥證書一類新藥證書。它源于中國人基因，最適于黃種人使用。 目前，我國已經(jīng)批準(zhǔn)了12種基因工程藥物和疫苗上市。幾種主要的連接策略幾種主要的連接策略1、同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端連接2、 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接3、不同限制性內(nèi)切酶粘性末

17、端的連接4、人工粘性末端的連接-5突出末端5、人工粘性末端的連接-3突出末端6、粘性末端的添加與更換，利用人工接頭Linker二、接（體外重組）（一）重組率-含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)（二）重組特性：粘性末端的重組率大大高于大大高于平末端。雙酶切片段與載體的重組率高于高于單酶切片段與載體。（三）提高重組率的方法1、加大外源基因片段與載體的比例2、選擇基因序列固有的酶切位點(diǎn)3、在利用PCR擴(kuò)增基因的同時引入酶切位點(diǎn)4、利用中間載體提供酶切位點(diǎn)1、加大外源基因片段與載體的比例（1）外源基因片段與載體的比例為5:1-10:1（2）5 末端去磷酸化2、 選擇基因序列兩側(cè)固有酶切位點(diǎn)選用酶

18、切位點(diǎn)選用酶切位點(diǎn), ,不能在基因序列內(nèi)部不能在基因序列內(nèi)部雙酶切產(chǎn)生粘端連接雙酶切產(chǎn)生粘端連接 單酶切單酶切粘端連接粘端連接 平端連接平端連接3、在利用PCR擴(kuò)增基因的同時引入酶切位點(diǎn) 利用PCR擴(kuò)增基因時，在引物序列中加入特定的限制性酶切位點(diǎn)序列，在擴(kuò)增基因的兩側(cè)就帶有了該特定酶切位點(diǎn)。4、 利用中間載體提供酶切位點(diǎn)例：Taq酶特點(diǎn)，常會在3末端添加一個脫氧腺苷酸（A），因此，為克隆PCR產(chǎn)物，設(shè)計一個特殊的載體-T載體載體，其特點(diǎn)是3末端含有一個脫氧胸腺苷酸（T）。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)過酶切直接與T載體連接，T/A克隆克隆隨后就可以利用質(zhì)粒上插入基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)來克隆基因。三、轉(zhuǎn)（外源基

19、因?qū)爰?xì)胞）（一）轉(zhuǎn)化方法 1、大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 2、酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法（二）轉(zhuǎn)化率（三）轉(zhuǎn)化率的用途（四）轉(zhuǎn)化率的影響因素1、大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（1 1）鈣離子轉(zhuǎn)化法）鈣離子轉(zhuǎn)化法（2 2）電轉(zhuǎn)化法）電轉(zhuǎn)化法（3 3）大腸桿菌的）大腸桿菌的 噬菌體轉(zhuǎn)染噬菌體轉(zhuǎn)染（1）鈣離子轉(zhuǎn)化法適用于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌），利用鈣離子與細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，這一狀態(tài)下的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。此時細(xì)胞經(jīng)過熱脈沖發(fā)生收縮作用，細(xì)胞膜出現(xiàn)間隙，此時質(zhì)粒DNA可通過進(jìn)入細(xì)胞。（2）電穿孔法將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)電穿孔轉(zhuǎn)化儀化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場

20、的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ袔缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。 2、 酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法（1）乙酸鋰轉(zhuǎn)化法（2）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法（3）電轉(zhuǎn)化法（二）轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率-單位質(zhì)量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生單位質(zhì)量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子的數(shù)量。的數(shù)量。鈣離子轉(zhuǎn)化法：鈣離子轉(zhuǎn)化法：106-109/ug 超螺旋質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法：電轉(zhuǎn)化法： 108-1010 /ug 超螺旋質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒例如，例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克，即每微克pUC18中

21、中只有只有108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有共有3.41011個分子（個分子（6.021017 / 2686660），即每），即每3400個個pUC18分子分子才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞，大約含有大約含有21010個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每每200個細(xì)胞個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納只有一個細(xì)胞能接納pUC18 DNA 。（四）轉(zhuǎn)化率的影響因素1 1、載體本身的性質(zhì)：、載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體

22、細(xì)不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。胞，其轉(zhuǎn)化率不同。2 2、載體的空間構(gòu)象：、載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的質(zhì)粒的超螺旋超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，高，經(jīng)酶切連接后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率要比新制備的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。其轉(zhuǎn)化率要比新制備的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。3 3、插入片段的大?。?、插入片段的大?。?對質(zhì)粒載體而言，對質(zhì)粒載體而言，插入片段插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低越大，轉(zhuǎn)化效率越低4 4、受體細(xì)胞的性質(zhì)：、受體細(xì)胞的性質(zhì)：不同菌株轉(zhuǎn)化效率有較大差異不同菌株轉(zhuǎn)化效率有較大差異5 5、受體細(xì)胞與載體的匹配：、受體細(xì)胞與載體的匹配：受體

23、細(xì)胞必須與載體相受體細(xì)胞必須與載體相匹配，如：匹配，如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株轉(zhuǎn)化率株轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。株的轉(zhuǎn)化率則較高。6 6、實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件方面：、實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件方面：實(shí)驗(yàn)操作對轉(zhuǎn)化率影響較大，實(shí)驗(yàn)操作對轉(zhuǎn)化率影響較大，特別是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化電壓，電容，電阻等參數(shù)的特別是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化電壓，電容，電阻等參數(shù)的設(shè)置非常重要。設(shè)置非常重要。四、增（重組基因的擴(kuò)增）增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞擴(kuò)增與表達(dá)載體上的標(biāo)記基因及目標(biāo)基因表達(dá)外源基因五、 檢（檢測轉(zhuǎn)化子，獲得重組子）1、抗藥性檢測篩選法2、顯色檢測3、限制酶切圖譜檢測4、PCR擴(kuò)增檢測5

24、、原位雜交檢測6、外源蛋白質(zhì)功能檢測1、抗藥性檢測篩選法 外源性外源性DNADNA插入到載體插入到載體DNADNA的某一抗藥性基因區(qū)域的某一抗藥性基因區(qū)域時，會導(dǎo)致抗藥基因的時，會導(dǎo)致抗藥基因的失活失活。轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生。轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。對于將外源DNA插入BamH和Sal之間位點(diǎn)IPTG可誘導(dǎo)可誘導(dǎo)LacZ基因片段編碼基因片段編碼-半乳糖苷酶氨基半乳糖苷酶氨基端片段端片段,與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，又稱現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，又稱互補(bǔ)。互補(bǔ)。當(dāng)培養(yǎng)基中有當(dāng)培養(yǎng)基中有IPTG時，時，

25、使含此質(zhì)粒的菌在使含此質(zhì)粒的菌在X-gal培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解半乳糖半乳糖iPO調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白P大腸桿菌的大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)系統(tǒng)a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突變體突變體M15藍(lán)藍(lán)- -白白篩選：篩選： 利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。 載體：載體：編