偽狂犬病活疫苗講述

1、偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)生產(chǎn)工藝規(guī)程編制人廠 年月日審核人： 年月日批準(zhǔn)人： 年月日一、目 的：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn)工藝規(guī)程的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程四、責(zé)任者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文：I工藝流程及質(zhì)量控制要點II操作細(xì)則1、制苗材料的制備2、生產(chǎn)用種毒的制備3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分裝6、疫苗的凍干7、軋蓋貼標(biāo)8、包裝III成品檢驗IV工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生V生產(chǎn)設(shè)備一覽表VI包裝機(jī)檢查方法VII物料平衡VII

2、I勞動定員及勞動保護(hù)吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件題目偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn) 工藝規(guī)程編碼：SOP-SC-共13頁制定審核批準(zhǔn)制定日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門辦公室頒發(fā)數(shù)量生效日期分發(fā)單位辦公室、勺匸產(chǎn)技術(shù)部、質(zhì)管部一、U 的：規(guī)定制造偽狂犬病活疫苗（B吐tha-K61株）的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程四、責(zé)任者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文:【品名】偽狂犬病活疫苗（Barthd-K61株）【質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)】本企業(yè)偽狂犬病活疫苗（Barthd-

3、K61株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)【外觀】本品為淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解?！疽?guī)格】10頭份/瓶、20頭份/瓶、70頭份/瓶【儲藏】在-15°C以下，有效期暫定為18個月【作用與用途】用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征。免疫期為4個月?！居梅ㄅc用量】1按瓶簽注明的頭份加生理鹽水稀釋，耳根后部肌肉注射。2仔豬斷奶前免疫1次，1頭份/頭。3母豬配種前免疫1次，1頭份/頭?！境善反a】C【批量】40000 瓶I工藝流程及質(zhì)量控制要點偽狂犬病活疫苗（B吐tha-K61株）質(zhì)量控制要點工序質(zhì)量控制要點質(zhì)量控制項目頻次毒種制備種毒無菌檢驗每批病毒含量每批細(xì)胞制備消化時間、溫度每批細(xì)胞外源

4、病毒檢驗每批毒液制備接種接種量每批觀察細(xì)胞再生狀況每批半成品檢驗無菌檢驗每批病毒含量每批配苗半成品、保護(hù)劑無菌檢驗每批配苗比例每批分裝分裝過程無菌檢驗分裝過程中前、中、后檢驗分裝量間隔半小時標(biāo)定分裝量凍干凍干曲線共融點、真空度每批成品檢驗成品理化指標(biāo)每批無菌檢驗每批鑒別檢驗每批效力檢驗每批安全檢驗每批外源病毒檢驗每批支原體檢驗每批II操作細(xì)則本品系用偽狂犬病病毒弱毒株接種于雞胚成纖維細(xì)胞收獲感染病毒液，加適宜穩(wěn)定劑, 經(jīng)冷凍干燥制成，用于預(yù)防豬、牛及綿羊偽狂犬病。1制苗材料的制備1.1條件準(zhǔn)備1.1.1根據(jù)細(xì)胞制備所需物品及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。1. 1. 2 按使用時間，提前做好滅菌工作后

5、將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。1.1.3在工作開始前3040min,按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級別要求。1.2操作規(guī)則1.2. 1細(xì)胞的制備1.2. 1. 1制苗用細(xì)胞的來源發(fā)育良好的910日齡SPF雞胚。1.2. 1.2細(xì)胞制備選擇910日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，無菌取出雞胚，去頭、四肢和內(nèi)臟，放入滅菌的玻璃器川1中，用漢克氏液洗滌胚體，用滅菌剪刀剪成米粒大 小的組織塊，再用漢克氏液洗滌23次，然后加0.25%胰酶溶液（每胚4ml）, 37. 538. 5°C 消化2030分鐘，吸出胰酶溶液，用漢克氏液洗滌23次再加入適量的營養(yǎng)液（用

6、含5% 10%犢牛血清乳漢液，加適宜的抗生素適量）吹打，用46層紗布過濾，制成每lml含活細(xì) 胞數(shù)約100150萬的細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，形成單層后備用。細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)無細(xì)菌、霉菌（見無菌（純粹）檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）和支原體（見支 原體檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）污染，無特異性病變。將細(xì)胞凍融液接種Marc-145細(xì)胞，應(yīng)不出現(xiàn)任何病變（見外源病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）。1. 3清場和記錄1.3.1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。1. 3. 2全面填寫生產(chǎn)工序記錄。2生產(chǎn)用毒種的制備2. 1條件準(zhǔn)備2.1.1根據(jù)毒種制備所需物料及設(shè)備條件，

7、進(jìn)行全面準(zhǔn)備。2.1.2按使用時間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。2.1.3在工作開始前3040min,按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級別要求。-13-2.2操作規(guī)則2. 2. 1制苗用病毒液的制備2. 2. 2. 1細(xì)胞單層培養(yǎng) 將擴(kuò)大培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速曠12轉(zhuǎn)/小時。2.2. 1.2接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長液，按2% （V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37° C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時）培養(yǎng)。2. 2. 1. 3收獲 在顯微鏡下觀察111病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至CPE達(dá)到70%以

8、上收獲細(xì) 胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片，凍存于-40° C以下。2.2.2毒種鑒定2. 2. 2. 1弱毒標(biāo)準(zhǔn)2. 2. 2. 2病毒含量 將毒種用無血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10匕10”、10一；4個稀釋度，分別接種于96孔細(xì)胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔0. ImL,設(shè)置正常的細(xì)胞對找孔, 放置5%CO:, 37°C下培養(yǎng)觀察35日，根據(jù)Reed-Muench法計算TCI%。病毒含量應(yīng)107 °TCID50o2. 2. 2. 3鑒別檢驗中和試驗：將毒種用無血清培養(yǎng)基稀釋成103TCID50/mL,取0. ImL與等量呼吸綜合征病 毒特異

9、性陽性血清混合，同時設(shè)病毒對照組和正常細(xì)胞對照組，37°C作用1小時后，接種 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察5日。應(yīng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）。1. 2. 2. 2病毒基因鑒定 應(yīng)用下列引物進(jìn)行RT-PCR檢測，毒種可擴(kuò)增出581bp的特異性條帶, 以而豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXA1-R株為代表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒以 及其他豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸為陰性（豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株RT-PCR檢 測方法見附注3）。U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTCD2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT2. 2. 2. 4 毒力對仔豬的毒力

10、 用JXA1-R-R株毒種（MlOrcm/nL）接種4、6周齡抗原豬繁殖與 呼吸綜合征病毒、抗體陰性仔豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見附注1） 5頭，每頭頸部肌肉注射2mL,同時 設(shè)5頭陰性豬作對照，隔離飼養(yǎng)。接種豬逐日測量體溫，觀察臨床癥狀，均不發(fā)?。òl(fā)病豬 判定標(biāo)準(zhǔn)見附注2 ）。對妊娠母豬的毒力 用JXA1-R-R株毒種（事訶°TCID5°/mL）接種懷孕80為0天的母豬 3頭，每頭頸部肌肉注射2mL,同時設(shè)同期懷孕母豬3頭做對照，隔離飼養(yǎng)，觀察母豬臨床癥 狀和分娩產(chǎn)仔狀況。懷孕母豬應(yīng)不發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬的存活率與未接種對照組無統(tǒng)計學(xué)差 異。2. 2. 2. 5免疫原性 取46周齡豬繁

11、殖與呼吸綜合征病毒抗原、抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn)見 附注1） 10頭，其中5頭肌肉注射JXA1-R-R株毒種2mL （105 °TCID5o/mL）,另5頭作為對照, 同條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬肌肉注射檢驗用強(qiáng)毒NVDC -JXA1株病毒培養(yǎng)液（病毒 含量lO15TCID3o/mL） 3mL,每天測溫并觀察21日。對照豬均應(yīng)發(fā)病，且至少2頭死亡，免 疫豬應(yīng)至少4頭保護(hù)（發(fā)病豬判定標(biāo)準(zhǔn)見附注）。2. 2. 2. 6純凈 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。2. 2. 3基礎(chǔ)種子代數(shù)82、90代。2. 2. 4 種毒保存-70°C下，保存期暫定

12、為12個月。2. 2. 5強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)2. 2. 5. 1病毒含量將毒種用無血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取IO'3. 10- ICT5、10勺個稀 釋度，分別接種于96孔細(xì)胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔0. ImL,在37°C下培養(yǎng)觀察外7 日，根據(jù)Reed-Muench法計算TCID。病毒含量應(yīng)105 5TCID5o/mLo2. 2. 5. 2對豬的毒力 取曠10周齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原抗體陰性豬（陰性豬標(biāo)準(zhǔn) 見附注1） 5頭，每頭豬肌肉注射檢驗用強(qiáng)毒NVTC-JXA1-R （1O, s's oTCID5o/idL） 3mL,每天測溫 并觀察21 Bo豬均應(yīng)發(fā)病

13、，且至少2頭死亡。1.3.3毒種代次56代。2. 2.6毒種保存 在-70°C以下，保存期暫定為12個月。3細(xì)胞系病毒培養(yǎng)用細(xì)胞為Marc-145,山中國動物疫病預(yù)防控制中心鑒定、保管和供應(yīng)。3. 1細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)3. 1. 1細(xì)胞形態(tài)用含8%犢牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C.5%C02培養(yǎng)2h即可貼壁，24h 內(nèi)可長成單層。顯微鏡下，細(xì)胞呈三角形、多角形、圓形等多種形態(tài)。3. 1. 2外源病毒檢驗3. 1. 2. 1致細(xì)胞病變病毒檢驗 取2個細(xì)胞單層，每個單層至少6cm',培養(yǎng)7天，每日觀察細(xì) 胞，應(yīng)無細(xì)胞病變。3. 1.2. 2血吸附病毒檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)

14、行檢驗，應(yīng)無紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。3. 1.2.3其它特定病毒的檢驗 采用PCR或RT-PCR方法檢測，應(yīng)無BVDV、PCV、CSFV、PPV、 PRV和JEV污染。3.1.3胞核學(xué)檢查 對不同傳代水平的細(xì)胞，取50個處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查。在 基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞中存在的染色體標(biāo)志，在最高代次細(xì)胞中也應(yīng)存在。與基礎(chǔ)細(xì)胞庫的細(xì)胞相 比，所有細(xì)胞的染色體模式數(shù)不得高出15%。核型必須相同。3. 1. 4致瘤性檢驗 用無胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射10個待檢細(xì)胞，同時用Hela 細(xì)胞皮下或肌肉注射無胸腺小鼠，每只1（/個細(xì)胞，作為陽性對照，用雞胚成纖維細(xì)胞作為 陰性對照。觀察21日，Marc-

15、145細(xì)胞應(yīng)無腫瘤形成，陽性對照組應(yīng)出現(xiàn)明顯的腫瘤，陰性 對照組應(yīng)為陰性。3.1.5無菌檢驗按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。3.1.6支原體檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗，應(yīng)無支原體生長。3. 2細(xì)胞代次 基礎(chǔ)細(xì)胞應(yīng)為P10代，工作細(xì)胞代次應(yīng)為1025代，生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)在40代 以內(nèi)。3. 3保存 液氮保存。保存期36個月。4 疫苗制造及半成品檢驗4. 1生產(chǎn)用毒種制備4. 1. 1毒種繁殖 將已長成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長液,換以含2%毒種的細(xì)胞維持液, 置37°C下培養(yǎng)2、3天，當(dāng)70%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲，置-40C凍融1次，離心后分裝， 然后進(jìn)行鑒定。4. 1

16、. 2毒種鑒定 按1.2.1、1.2.2、1.2.5項進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的毒種作為 生產(chǎn)用毒種。4. 1. 3毒種保存 在-70°C下保存，應(yīng)不超過12個月。4. 1.4毒種繼代 應(yīng)不超過3代。4. 2清場和記錄4. 2. 1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。4. 2. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。5半成品的制備5. 1條件準(zhǔn)備5.1.1根據(jù)毒液繁殖所需物料及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。5.1.2按使用時間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。5.1.3在工作開始前3040min,按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級別要

17、求。5.2操作規(guī)則5.2.1 接種 取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長液，按2% （V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37° C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時）培養(yǎng)。5.2.2 收獲 在顯微鏡下觀察III病毒引起的細(xì)胞病變（CPE）,直至CPE達(dá)到70%以上收獲 細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片，凍存于-40° C以下。5. 3半成品檢驗5. 3. 1病毒含量取病毒液按1. 2. 1項進(jìn)行檢驗，病毒含量應(yīng)lOTCIDso/mLo5. 3.2 無菌檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。5. 4清場和記錄5. 4. 1工作結(jié)

18、束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)行處理。5. 4. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。6配苗6. 1條件準(zhǔn)備6.1.1根據(jù)配苗所需物料及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。6.1.2按使用時間，將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。6.1.3在工作開始前3040min,按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級別要求。6.1.4將檢驗合格的半成品于配苗前取出，融化待用。6.2操作規(guī)則6. 2.1配制將經(jīng)檢驗合格的病毒液按比例添加蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑，充分混合均勻。6. 3清場和記錄6. 3.1工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī) 定分別進(jìn)

19、行處理。6. 3. 2全面填寫生產(chǎn)記錄。7疫苗的分裝操作內(nèi)容見分裝崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。8疫苗的凍干操作內(nèi)容見凍干標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。7軋蓋、貼標(biāo)操作內(nèi)容見軋蓋標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、貼標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。8包裝操作內(nèi)容見包裝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程III成品檢驗見偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程IV、工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生1定期對潔凈室進(jìn)行消毒，并根據(jù)沉降菌測定結(jié)果決定消毒周期。2操作間的衛(wèi)生按各自區(qū)域的清潔消毒規(guī)程進(jìn)行。3生產(chǎn)設(shè)備按各自清潔規(guī)程進(jìn)行清潔消毒。4原輔料進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)按規(guī)定程序進(jìn)行清潔消毒。5人員進(jìn)入潔凈區(qū)時，必須按規(guī)定進(jìn)行人凈。進(jìn)入潔凈區(qū)程序：更鞋一脫外 衣一穿普通工作服一更鞋一脫普通工作服一洗手-> 穿潔凈服一手消毒一進(jìn)入十萬 級潔凈區(qū)一更鞋一手消毒一套潔凈服一手消毒一進(jìn)入萬級潔凈區(qū)。6人員在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)按區(qū)域個人衛(wèi)生要求進(jìn)行管理。7 一般區(qū)工作服每三天清洗一次，十萬級區(qū)工作服每天清洗一次，萬級區(qū)工 作服每班清洗一次，萬級潔凈區(qū)使用的工作服在清洗后進(jìn)行滅菌，活毒操作區(qū)的工 作服須經(jīng)滅菌后才能進(jìn)行清洗。8潔凈室溫度控制在1826°C,相對濕度控制在30-63%。潔凈區(qū)與非潔凈 區(qū)的靜壓差應(yīng)$10帕。不同級別的相鄰潔凈區(qū)間壓差應(yīng)$5帕。9每批生產(chǎn)完畢，都應(yīng)按清場管理規(guī)程進(jìn)行清場。更換產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行徹底清