菌種鑒定手段

1、菌種鑒定手段(1)常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和生理生化特征。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和 培養(yǎng)特征；理化特性包括營(yíng)養(yǎng)類型？碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)等。(2) BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對(duì)不同碳源的利用情 況為基礎(chǔ)，檢測(cè)微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò) 軟 件將待測(cè)微生物與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，得出鑒定結(jié)果。該系統(tǒng)已獲美國(guó)FDA認(rèn)可，已逐步應(yīng)用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物'生物治理、化妝品、臨床等領(lǐng)域的微生物鑒定試驗(yàn)中。BIOLOG是一種微生物菌種快速鑒定系統(tǒng)，涉及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、厭氧 菌

2、、酵母、絲狀真菌在內(nèi)近 2000種微生物。(3)分子生物學(xué)鑒定應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明微生物種群之間的分 類學(xué)尖系，是目前 微生物分類學(xué)研究普遍采用的鑒定方法。CICC擁有微生物菌種 分類鑒定的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，配有 PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進(jìn)儀器設(shè)備，以及 DNAMAN、 BIOEDIT、 CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析軟件。目前 CICC可采用核酸序 列分析法分析細(xì) 菌 16S rDNA/16S-23S rDNA 區(qū)間序列、酵母 18S rDNA/26S rDNA(D1/D2 )序列及絲狀 真菌的18S rDN

3、A/ ITS1-5.8S-ITS2 序列，提供科學(xué)的鑒定結(jié) 果。(4) API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個(gè)鑒定系列，約有1000種生化反應(yīng)，目前已可鑒定超過(guò) 600種 的細(xì)菌。鑒定過(guò)程中，可根據(jù)細(xì)菌所屬類群選擇適當(dāng)?shù)纳砩b定系列，通 過(guò)軟件 將待測(cè)細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，得出鑒定結(jié)果。CICC目前可應(yīng)用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列對(duì)乳酸桿菌 (Lactobacillus sp.)和相尖細(xì)菌、芽抱桿菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp).、微球菌屬(Micrococcus sp.)禾口庫(kù)克菌屬(Locuri

4、a sp.)進(jìn)行鑒 定。(5 )功能性分析及功能基因CICC不斷致力于工業(yè)微生物資源的功能及其功能基因研究，目前通過(guò)木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、P ?甘露聚糖酶等功能基因的克隆進(jìn)行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應(yīng)用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株 間 有較好的分辨效果。(6) RAPD、SSCP 技術(shù)隨著微生物菌種應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展，在食品安全管理、生物產(chǎn)品出口認(rèn)證、知識(shí) 產(chǎn)權(quán) 保護(hù)等行業(yè)需求日益增加，微生物菌種株水平的鑒別技術(shù)成為一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。CICC 采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (Randomly amplified polymorphism

5、 DNA 、 RAPD ) 技術(shù)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single Strand Conformation Polymorphism 、SSCP)技術(shù)對(duì) 微生物菌株進(jìn)行鑒別。如采用 RAPD技術(shù)能夠?qū)ν痪N原始菌株與 誘變菌株進(jìn)行鑒別，對(duì)誘變菌株知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義；采用 SSCP技術(shù)進(jìn)行工業(yè)酒精酵母菌株 的鑒別，此技術(shù)結(jié)合菌株發(fā)酵特性，在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用。(7) TLC薄層層析CICC將TLC薄層層析技術(shù)應(yīng)用于微生物菌種鑒定，進(jìn)行細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁化學(xué)組分分析(氨基酸、糖)，作為劃分屬特征的重要鑒定技術(shù)手段，起到了良好的輔助 作 用。(8)全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng)采用S

6、herlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析，并 與標(biāo) 準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，來(lái)鑒定細(xì)菌及酵母。該技術(shù)是細(xì)菌或酵母種水平鑒定的有效手段之一。(9) ( G + C) mol%及DNA/DNA 雜交CICC通過(guò)采用DU800核酸蛋白分析儀測(cè) 定 Tm值，從而得到微生物菌株的(G + C) mol% ,并與模式菌株進(jìn)行 DNA/DNA同源性分 析，該鑒定技術(shù)手段是多相鑒定的重要組成部分。(10) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是特異性靶基因檢測(cè)與定量的一體化系統(tǒng)，其將PCR熱循環(huán)、熒光檢測(cè)和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動(dòng)態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各 反應(yīng)管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

7、逐漸增加的情況。根據(jù)熒光強(qiáng)度確定PCR產(chǎn)物的定量法 主要有熒光染料(SYBR Green I)法和熒光探針(Taqman probes)法。與 常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決 PCR污染問(wèn)題、自動(dòng) 化程度更高等特 點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)目前已得到廣泛應(yīng)用，包括基于相對(duì)定量分析的基因表達(dá)分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)的菌株絕對(duì)定量分析，定性的 PCR擴(kuò)增 后核酸 序列的SNP 基因型分析，以及以陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照為基礎(chǔ)的陽(yáng)性/陰性結(jié)果判定 等。(11) 微生物菌群分析(DGGE) DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis )即 變性梯度凝膠電泳，

8、是根據(jù) DNA在不同濃度的變性劑中解鏈 行為的不同而導(dǎo)致電泳遷 移率發(fā)生變化，從而將片段 大小相同而堿基組成不同的 DNA片段分開。DGGE已廣 泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢(shì)種類信息并同時(shí)分析多個(gè)樣品，具有可重復(fù)和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化，并且可通過(guò)對(duì)條帶的序列分析或 與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。(12)微生物菌群分析(克隆文庫(kù)構(gòu)建)當(dāng)微生物菌群中含有不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)菌種，且其豐度較低時(shí)，要全面解析菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，只采用傳統(tǒng)的平板分離或PCR-DGGE分析難以達(dá)到理想結(jié)果，這時(shí)可以結(jié)合構(gòu)

9、建16S rDNA克隆文庫(kù)的方法。細(xì) 菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在UV下顯現(xiàn)，從膠 上切取DNA條帶，經(jīng)純化后，鏈接到 pGEM?-T Easy載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 (Escherichia coli)。待長(zhǎng)出白 色菌落后，挑選白色菌落進(jìn)行菌落PCR-DGGE(16SrDNA V3)輔助篩選，得到特定菌群中的所有克隆菌，再經(jīng)質(zhì)粒提取，基因測(cè)序 后，便 可得到特定微生物菌群信息。(13)細(xì)菌呼吸醍組分測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜上的呼吸醍有甲基蔡醍(menaquinone , MK )和泛醍(ubiquinone ,輔酶Q)。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的放線菌而言，通常只含有甲基蔡醍

10、。常用來(lái)分析呼吸 醍的方法有薄板層析法和高壓液相色譜法等。醍分子中的多烯側(cè)鏈長(zhǎng)度 及氫飽和度對(duì)于細(xì)菌具有重要的分類學(xué)意義。(14)細(xì)菌磷酸類脂分析磷酸類脂(phospholipioides)屬極性脂(polar lipid ),與蛋白質(zhì)、糖等構(gòu)成細(xì)胞 膜，對(duì) 于物質(zhì)運(yùn)輸、代謝及維持正常的滲透壓都有重要作用。不同屬菌的磷酸類脂組分是不同的，它是鑒別屬的重要特征之一，是化學(xué)分類項(xiàng)目中不可缺少的分類指征。磷脂種類很多，對(duì)于放線菌而言，具有分類學(xué)意義的磷酸類脂有5種：磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine , PE)、磷月旨酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)、