淺談怎么切好冰凍切片(轉(zhuǎn)載自丁香園)

1、冰凍包埋組織固定冰凍切片免疫組化操作各類組織實(shí)際操作技巧（連載補(bǔ)充）精華切片技術(shù)最早期是從冰凍切片開始，后來(lái)逐步有了發(fā)展和更新，冰凍切片彌補(bǔ)了石蠟切片和火棉膠切片之不足，石蠟切片和火棉膠切片需時(shí)太久，且在制片中要使用許多化學(xué)試劑，石蠟切片還需要加溫過(guò)程，因而某些重要的不穩(wěn)定的組織成分如脂類、酶以及抗體等，可能被溶解和破壞。冰凍切片過(guò)程較簡(jiǎn)單，無(wú)須經(jīng)過(guò)上述步驟，組織中的水分起著包埋劑的作用，組織經(jīng)固定或不固定即可進(jìn)行冰凍切片，切片厚度一般可在6-8 微米，組織沒(méi)有收縮，易保持生活時(shí)原有狀態(tài)，是保存脂肪組織，許多神經(jīng)組織特殊染色方法和組織化學(xué)方法，特別是酶的活性十分理想的切片方法， 對(duì)于外科臨床診

2、斷和現(xiàn)代免疫熒光診斷，冰凍切片也很重要。其缺點(diǎn)是組織過(guò)大不易冰凍，連續(xù)切片困難。一、直接冰凍切片法冰凍切片多用于新鮮組織、甲醛固定組織和冰箱冷藏組織等。組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后再進(jìn)行切片。1 恒冷箱切片就是將組織在恒冷箱的切片機(jī)切片。目前恒冷箱切片機(jī)的品種較多。此種切片適用于科研和教學(xué)上的連續(xù)切片。要求預(yù)先開動(dòng)電源（預(yù)冷準(zhǔn)備），配多種固定組織臺(tái)，以便更換組織。2甲醇制冷器制冷箱為附有帶導(dǎo)管的制冷臺(tái)和制冷刀的甲醇循環(huán)裝制，其冷卻速度比較快，屬于開放式，作一般常規(guī)冰凍切片用。3二氧化碳冰凍法將組織用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機(jī)的冷凍臺(tái)上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺(tái)的二氧化碳開關(guān)，二

3、氧化碳?xì)怏w噴出，待組織出現(xiàn)冷霜時(shí)，將二氧化碳關(guān)閉，即可切片。若組織冷凍過(guò)硬則切片易碎；組織冷凍硬度不足，則切片呈粥糜狀，需用間歇方法繼續(xù)冷卻。硬度一般在剛開始解凍時(shí)最合適，應(yīng)迅速切片。4半導(dǎo)體致冷冰凍切片法將組織置半導(dǎo)體致冷臺(tái)上，滴加少許蒸餾水，調(diào)好切片機(jī)的厚度。先接通熱器的循環(huán)流水，然后接通電源，電源的正負(fù)極切勿接反，用整流電源控制溫度。移至25%明膠溶液內(nèi)浸6-24h。 25%明膠包埋，連同包埋器放入冰箱內(nèi)使明膠迅速凝固，取出后在空氣中蒸發(fā)10min 。入固定明膠塊1-2 日。蒸儲(chǔ)水洗后，置冰凍切片機(jī)或滑動(dòng)式切片機(jī)切片。切片可保存于10%甲醛液中。依檢查目的而進(jìn)行染色，染色后一般不經(jīng)乙醇脫

4、水及二甲苯透明，而用下述明膠溶液或其他類似的明膠溶液封片：果糖26g,明膠1.1g,鉀磯0.75g,麝香草酚水溶液1.15ml。先將果糖溶于麝香草酚飽和液，置于56c溫箱內(nèi)12h,加明膠后在水浴內(nèi)加溫熔化，過(guò)濾后加鉀磯。于100ml溶液內(nèi)加甲醛2ml 防腐。三、冰凍切片粘片法1. 2. Lillie明膠粘片法將切片放入 1%明膠水溶液數(shù)分鐘，撈出置于載玻片上，將多余液體傾去。入5min,水洗10min , 即可染色。3乙醇明膠粘片法切片浸入0.1%或 0.75%明膠溶液（以40%乙醇配制）數(shù)分鐘，撈于載片上，經(jīng)室溫短時(shí)干燥，入氯仿1min , 經(jīng) 95%及 70%乙醇洗去氯仿，再經(jīng)蒸餾水洗后染

5、色。四、冰凍包埋液包埋切片OCT Compound 法現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外有許多廠家用高分子材料配制成冰凍切片包埋液，將冰凍包埋液直接可直接在切片機(jī)組織卡盤（chuck）上加少許包埋液，在其固化前嵌入組織塊，然后再于組織周圍加入少許包埋液穩(wěn)定。常規(guī)切片，厚度2-100 微米?；蛘咴谑?biāo)本的包埋模具內(nèi)，擠出適量冰凍包埋液，放入組織塊或細(xì)胞沉淀塊，加包埋劑完全淹沒(méi)組織塊，如有氣泡可用針頭或吸頭吸出。速凍：將盛有組織細(xì)胞和包埋液的模具，正置于切片機(jī)冷室內(nèi)冰凍10 分鐘，至包埋液固化。也可將盛有組織的模具置于液氮或-40-70 度冰箱冰凍固化保存，用前取出置于切片機(jī)冷室內(nèi)平衡溫度（否則損壞刀片） 。冰凍切片組織

6、塊的準(zhǔn)備1. 調(diào)整好組織與刀片的方向這是冰凍切片準(zhǔn)備中極為重要的方面，可以使這項(xiàng)工作變得簡(jiǎn)單，在我的工作中我總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn)可供參考。a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不夠，對(duì)絕大多數(shù)組織均合適的溫度卻切不好脂肪組織，如果一刀下去，組織中的脂肪先接觸刀片，就會(huì)破碎并使整個(gè)片子損壞。如果脂肪最后接觸刀片，則切片過(guò)程不受干擾。最糟糕的情況是脂肪部分先接觸刀片而沒(méi)有）的保護(hù)，可以給片子提供一個(gè)起始的緩沖，如果沒(méi)有包埋，脂肪就會(huì)切碎并把整個(gè)片子破壞。當(dāng)切片過(guò)程中由于脂肪的出現(xiàn)而影響質(zhì)量時(shí)，我要么把搖柄轉(zhuǎn)回去盡量避免，要么把脂肪挖出來(lái)。b.組織與刀片垂直或成角是關(guān)鍵。讓我們假設(shè)組織由起始端、中間部分及末尾端

7、三部分構(gòu)成，起始端容易卷縮，或 受到刷子的損害，還可能由于操作者的猶豫而引起片子的厚薄不均，這些都增加了假象的風(fēng)險(xiǎn)。末尾端在貼片時(shí)容 易拉長(zhǎng)，最好的是中間部分，最不可能出現(xiàn)假象，并且組織學(xué)上最干凈，這是片子中最理想的部分。非常堅(jiān)實(shí)的組織容易產(chǎn)生橫皺，切片時(shí)應(yīng)包埋成角且盡可能的加溫。成角包埋就像坐著船沖浪一樣，如果你直線行 駛，就會(huì)承受波浪線上最大的沖擊，如果成角行駛，波浪線就會(huì)拉伸，所受的顛簸也會(huì)減小。跟公路上的減速脊一 樣的原理。上皮和粘膜貼附的組織如皮膚，胃腸，膀胱，子宮，頸部等，應(yīng)當(dāng)使上皮面垂直于刀片(見下圖) 。D/ £ S J2.組織塊的溫度當(dāng)溫度、任何組織都有一個(gè)理想的切

8、片溫度，在此溫度下切片，組織片以平滑均一的形式流過(guò)刀片，幾乎沒(méi)有卷縮。組織類型、刀片均處于理想狀態(tài)時(shí)，切片十分流暢，幾乎不用刷子。如果溫度太低，片子容易卷曲和破碎；如果溫 度太高，片子就會(huì)皺成一堆。如果需要加溫，只需要把大拇指置于組織塊面幾秒鐘；如果需要降溫，可以使用機(jī)子 的精確低溫包埋系統(tǒng)，簡(jiǎn)單的做法就是把過(guò)凍的凍臺(tái)放在組織面上幾秒鐘，大多數(shù)的冰凍切片機(jī)都有一種熱吸收器 可以使用。(2)針頭的移除在工作中經(jīng)常會(huì)收到布滿針頭的標(biāo)本，有時(shí)候針頭會(huì)穿過(guò)整個(gè)組織，導(dǎo)致刀片的損壞并使片子一分為二，下面有種簡(jiǎn)單的解決辦法。a組以塊內(nèi)的4頭"。出鉗：.1 L。旋麗子并將¥1頭早.弧屈拉

9、出：4在打織就 損處沿幾清包埋胸：e用與f 朦臺(tái)面壓i II4面：tg體臉的和悔整后的組織面 西奈山冰凍切片組織包埋液nm sinai918. cow 1335n68996接到標(biāo)本后快速冰凍。2、切片厚度67微米。3、切片完整，無(wú)污染，無(wú)皺褶。4、切片完成后立即固定。5、染液，脫水液必須及時(shí)更換。6、封固前必須經(jīng)酒精脫水，。7、封片時(shí)不得有氣泡，不得有樹膠外溢。8、標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè)，編號(hào)字跡必須清楚。9、制片工作一般應(yīng)在15 20 分鐘內(nèi)完成。10 、冰凍報(bào)告后及時(shí)將“冰對(duì)”組織放入內(nèi)。11 、每天操作完成后，及時(shí)對(duì)機(jī)器進(jìn)行清理和消毒。（ 3）縫線的移除（ 4）挖鑿的技術(shù)學(xué)會(huì)看片子這里指的

10、是片子滑過(guò)刀片時(shí)就要辨別出質(zhì)量的好壞，如果到鏡下才發(fā)現(xiàn)片子的缺陷那就無(wú)法挽救。1. 觀察片子的厚薄，但人為辨別片子的厚度是否合適仍然很重要。片子太薄看起來(lái)象半透明的鏡紙，片子太厚看起來(lái)混濁、柔性差，對(duì)我來(lái)說(shuō)，5-6um 的片子較合適，象一張薄的打印紙。3.片子上的條紋垂直于刀片的細(xì)條紋為刀片缺口所致，這往往是切到鈣化組織、針頭或縫線的結(jié)果。4.波浪線樣的橫皺脂肪組織的處理1 . 盡可能的削掉不需要的脂肪組織當(dāng)我準(zhǔn)備切淋巴結(jié)時(shí)，我會(huì)先檢查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓內(nèi)的脂肪，結(jié)內(nèi)的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜線附近的脂肪用刀切除，這樣就不需要切開整個(gè)淋巴結(jié)被膜。有人會(huì)說(shuō)，我把一些組織去掉后，可能導(dǎo)致

11、漏判一些陽(yáng)性的淋巴結(jié)，但我的經(jīng)驗(yàn)是好的干凈的片子比含有太多脂肪的差片子更容易獲得陽(yáng)性的結(jié)果。當(dāng)你在休整組織或切片的過(guò)程中脂肪組織意外出現(xiàn)時(shí)，你也可以使用前面的挖鑿技術(shù)。2 .調(diào)整組織塊的方向使脂肪最后接觸刀片切片時(shí)盡量避免脂肪先接觸刀片，因?yàn)橹緯?huì)脫離包埋物，在切片上留下一個(gè)洞，如果不能避免，也要在其周圍加上包埋物，讓包埋物先接觸刀片。3 .保證刀片、臺(tái)面的干凈及組織塊的冷凍程度切片機(jī)的臺(tái)面和刀片必須保持干凈，假如你弄碎了一張片子必須即時(shí)用一塊干紗布清理干凈，但要防止刀片割手，如果你發(fā)現(xiàn)切出來(lái)的片子有條紋或者堆積成束，可能是組織粘著在刀片的下方了，必須除掉刀片上的組織，并將刀片清理干凈。組織塊

12、越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪組織就變得堅(jiān)硬難切，同時(shí)水性的組織會(huì)裂開，這就有必要在切片溫度的最冷端和最溫端取一個(gè)二者兼顧的中間值，以使脂肪和非脂肪組織都能切好。我一般將組織塊凍在-24 度，可以獲得滿意的結(jié)果，冷凍噴霧劑有用，但要注意先清掉切片機(jī)內(nèi)的污穢。冰凍切片的基本技術(shù)1 . 從鋒利的刀片開始我發(fā)現(xiàn)使用新的鋒利的刀片時(shí)常常做出高質(zhì)量的片子。我覺(jué)得在醫(yī)療場(chǎng)合中某些盡量省錢的做法顯得有些因小失大。一般我對(duì)每位患者的標(biāo)本都使用一組新的刀片，當(dāng)片子的質(zhì)量開始下降時(shí)，我會(huì)立刻更換刀片。某些組織如質(zhì)地較硬的膠原和鈣化組織會(huì)使刀片很快變鈍，因此，經(jīng)常更換刀片顯得很有必要，有時(shí)候我在切片過(guò)程中要連續(xù)

13、更換 2-3 次刀片。2 .坐著還是站著我切片時(shí)總是坐在一張凳子上。要學(xué)會(huì)把刷子作為一種便捷的輔助工具來(lái)操作，從而精細(xì)地控制顯微厚薄程度的片子。切片時(shí)俯身彎腰，頸部過(guò)伸的姿勢(shì)有些不妥，要盡量處于放松和舒適的姿勢(shì)以便能最大程度控制你的左手。3 .刷子4 .握持刷子左手象拿筆一樣握持刷子，將第五指輕壓于臺(tái)面上以穩(wěn)定握筆的手（或根據(jù)手和切片機(jī)尺寸的大小置于你感覺(jué)合適的地方）， 這樣可以保證操作者動(dòng)作的靈活及可控性。我把刷子削成一個(gè)角度，大致與左手握持刷子的角度相同，這樣使刷子平著接觸組織的1/4。5 .搖柄的旋轉(zhuǎn)以連續(xù)均勻的力量轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的搖柄，且要毫不猶豫。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開始切片

14、時(shí)總要停一下，緩慢的抓取組織，然后再開始轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄。依我的經(jīng)驗(yàn)看來(lái)，這種動(dòng)作增加了起始切片假象的可能，會(huì)使片子的厚度不均勻，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時(shí)，象前面所說(shuō)的那樣手握刷子，以一種連續(xù)的動(dòng)作抓取組織，這個(gè)動(dòng)作與刀片接觸組織同時(shí)開始并貫穿于整個(gè)過(guò)程。7 .貼片可以從切片機(jī)的臺(tái)面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一個(gè)角度粘住片子的一角，在靜電作用下片子會(huì)吸附在玻片上并迅速融化。當(dāng)然在周圍涂一些包埋物對(duì)貼片有利，這種多余的包埋物可以保護(hù)片子的邊緣免受皺縮的損壞。有時(shí)候碰到貼片困難，我會(huì)在切到最后2mm 包埋物的時(shí)候停下來(lái)，讓片子留在組

15、織塊上，然后倒轉(zhuǎn)搖柄，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平，這樣就可以從組織塊面貼片了，這對(duì)卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。8 .快速固定我右手轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄也同時(shí)拿著玻片，片子一切好，立刻粘起片子并將它浸沒(méi)于。需置于方便夠到的地方，我一般將染色架放在染色缸的旁邊，先將片子置于，然后插于染色架上。如果組織固定延遲會(huì)出現(xiàn)風(fēng)干的假象，我的經(jīng)驗(yàn)是組織片還在切片機(jī)的臺(tái)面時(shí)，風(fēng)干效應(yīng)很小，當(dāng)組織片粘在有溫度的玻片上時(shí)就會(huì)出現(xiàn)明顯的風(fēng)干假象，表現(xiàn)為核的細(xì)節(jié)丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲15 秒固定和立刻固定的相同組織的比較，差異非常明顯9 .切片的厚度冰凍切片的局限1 . 時(shí)間的限制2 .特殊染色的局限這個(gè)問(wèn)題討論起來(lái)很難，我們只能面對(duì)，當(dāng)今時(shí)代如果沒(méi)有免疫過(guò)氧化物酶染色和基因突變的檢測(cè)，仍然無(wú)法對(duì)淋巴瘤和肉瘤及其他類似的疾病進(jìn)行分類，也許不久的將來(lái)能有快捷的方法用于冰凍切片，但是現(xiàn)在，確實(shí)是一個(gè)缺陷。3 .冰凍假象這是水的特性，水在結(jié)冰時(shí)因氫鍵的交聯(lián)而膨脹，正是這個(gè)原因，冰塊才能浮在水面上。我相信組織在冰凍時(shí)候的變化與水結(jié)冰膨脹是密切相關(guān)的，在此，我會(huì)盡量解釋冰凍片子和石蠟片子的差異。象處理其他病理假象一樣，正確的識(shí)別這些冰凍假象有助于我們不至