最新電鏡目前的技術(shù)難點及未來發(fā)展趨勢

1、5冷凍電鏡目前的技術(shù)難點及未來發(fā)展趨勢與其他的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物物理學(xué)研究方法類似，冷凍電子顯微學(xué)在硬件設(shè)備上的長足進展解決了很多關(guān)鍵性的技術(shù)難點，使該方法的應(yīng)用普及成為趨勢。同時，一些其他的技術(shù)難點凸顯出來，成為結(jié)構(gòu)解析中的瓶頸，需要更多的關(guān)注與投入。5.1 樣品制備技術(shù)樣品制備一直是冷凍電子顯微學(xué)研究的關(guān)鍵步驟。對于生物大分子結(jié)構(gòu)研究來說，需要保證單顆粒分子以合適的密度均勻分布于厚度合適的無序冰中，才有可能獲得良好的電子顯微數(shù)據(jù)進行結(jié)構(gòu)解析。由于不同的生物大分子與樣品支持膜的相互作用及在水溶液中的性質(zhì) 各不相同，分子在樣品中的分布狀態(tài)各異。目前普遍采用的冷凍制樣技術(shù)在基本原理上仍然采用30年

2、前發(fā)明的方法，實驗可重復(fù)性、操作可移植性、通用性等都很差。樣品制備已經(jīng) 成為冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析的限速步驟。冷凍電子顯微學(xué)要想成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要應(yīng)用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似的，對于細胞結(jié)構(gòu)研究來說，將 本身很厚的細胞樣品進行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。 在過去的十多年里， 冷凍切片技術(shù)一直在穩(wěn)步發(fā)展，至今已經(jīng)成為相對成熟的技術(shù)，但是對該技術(shù)的熟練掌握仍然需要長期的培訓(xùn)與實踐經(jīng)驗。最近發(fā)展起來的聚焦離子束減薄技術(shù)在未來可能會對冷凍細胞樣品的結(jié) 構(gòu)研究帶來新的契機。5.2 高分辨率結(jié)構(gòu)的分析與建模應(yīng)用冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)在過去的兩年里所獲得的近原子分辨率（4?以上）

3、三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目幾乎超過了前面幾十年所獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)目之和。更多的在48?分辨率范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)在很短時間內(nèi)被解析出來，不同的分辨率結(jié)構(gòu)可以揭示出的結(jié)構(gòu)細節(jié)亦不同。而與晶體學(xué)手段不同，冷凍電子顯微學(xué)單顆粒重構(gòu)無法通過對晶格衍射點的信號強弱來判斷分辨 率。因此，如何客觀地對三維重構(gòu)的結(jié)果進行檢驗、明確結(jié)構(gòu)解析的分辨率是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的一個重要問題。在此基礎(chǔ)上，需要對不同分辨率水平的三維重構(gòu)進行原子模型的構(gòu)建，從而實現(xiàn)在原子水平上對分子功能的解釋。對于分辨率在 4?以上的三維重構(gòu) 基本可以應(yīng)用X射線晶體學(xué)現(xiàn)有的方法進行建模；對分辨率在4?以下的三維結(jié)構(gòu)如何建立 較為可信的模型，則仍缺少

4、相對成熟并被普遍接受的方法。一些研究組正在利用同源建模、 分子動力學(xué)模擬等手段來進行這一分辨率水平的原子模型搭建的嘗試。5.3 生物大分子構(gòu)象不均一性的分析冷凍電子顯微學(xué)單顆粒結(jié)構(gòu)解析技術(shù)與晶體學(xué)技術(shù)的一個重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結(jié)構(gòu)。但生物大分子尤其是大分子復(fù)合體本身的構(gòu)象柔性亦因此沒有被固定在晶體結(jié)構(gòu)中，這些構(gòu)象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導(dǎo)致三維重構(gòu)無法獲得高分辨率結(jié)構(gòu)的根源。將不同構(gòu)象的分子分開分析，是提高重構(gòu)分辨率的重要過程。此外，分子在溶液中的不同構(gòu)象很可能反映了分子發(fā)揮功能的不同結(jié)構(gòu)形態(tài)，理解這些構(gòu)象差異對于

5、解釋分子功能的機制非常重要。目前對生物大分子構(gòu)象不均一性的分析是冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析中的技術(shù)難點和熱點?，F(xiàn)有的一些算法通過聚類分析、最大似然法分析等對某些生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析取得了重 要的發(fā)現(xiàn)，但對這個問題的解決需要更多的新思路和新算法。5.4 電子光學(xué)新技術(shù)方法在生物樣品研究中的應(yīng)用材料科學(xué)超高分辨率研究在過去十幾年里也發(fā)生了很多重要的技術(shù)進步，主要是電子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進步，新的技術(shù)諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統(tǒng)等都在材料科學(xué)領(lǐng)域結(jié)構(gòu)分辨率的顯著提高中發(fā)揮了重要作 用。目前，利用最新的電子光學(xué)成像系統(tǒng)，物理學(xué)和材料科學(xué)研究者已經(jīng)可以

6、獲得0.5?的分辨率。隨著對生物樣品近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學(xué)發(fā)展的下一個目標。如何應(yīng)用材料科學(xué)領(lǐng)域證明對超高分辨成像卓有成效的電子顯微學(xué)方法來提高生物樣品的結(jié)構(gòu)解析分辨率，是擺在所有冷凍電子顯微學(xué)家面前的新機遇和挑戰(zhàn)。此外，新的技術(shù)如電子顯微鏡相位板(phase-plate)的開發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)被證明對于利用單顆粒技術(shù)解析小分子量的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及利用電子斷層掃描三維重構(gòu)技術(shù)研究細 胞結(jié)構(gòu)具有重大的促進作用。該項技術(shù)很可能在未來幾年里引起冷凍電子顯微學(xué)的另一次新 的重大突破。5.5 體內(nèi)結(jié)構(gòu)的研究自從上世紀中期建立以來，結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要是通過對分離純化至體

7、外的生物大分子結(jié)構(gòu) 進行解析。至今解析出來的多達10萬的生物大分子結(jié)構(gòu)對于我們理解生物學(xué)過程的分子機制發(fā)揮了重要的作用。但迄今為止，我們?nèi)詿o法通過直接觀察獲得細胞內(nèi)乃至體內(nèi)的生物大 分子的原子分辨率結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微學(xué)尤其是三維斷層掃描重構(gòu)的發(fā)展給我們提供了這樣 的契機。通過更穩(wěn)定的電子顯微鏡系統(tǒng)、更高效的數(shù)據(jù)采集裝置、更強大的計算機處理工具， 三維斷層掃描重構(gòu)將有可能幫助我們對細胞內(nèi)的特定分子結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)和統(tǒng)計分析，從而獲得它們的高分辨率結(jié)構(gòu)。如何對細胞中特定分子的標定則是目前冷凍電子顯微學(xué)細胞結(jié)構(gòu)研 究面臨的一個主要技術(shù)問題。如果能實現(xiàn)以上目標，冷凍電子顯微學(xué)將可能真正填補結(jié)構(gòu)生 物學(xué)與細

8、胞生物學(xué)之間的空隙，使得我們從不同空間與時間尺度上對生物體的理解更加完 整。6個人感悟與結(jié)論縱觀整個冷凍電鏡的工作流程，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡的基本工作原理其實不難以理解，但整個冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)非常的龐大與復(fù)雜，目前可以生產(chǎn)并且銷售這種昂貴的冷凍電鏡的公司也只有美國FEI等少數(shù)幾家專業(yè)的顯微鏡制造公司，顯然目前我國還并沒有掌握這種高精尖儀器的生產(chǎn)制造技術(shù)，我國整體的科學(xué)儀器制造水平與美國等西方發(fā)達國家相比仍然是存在 較大的差距。結(jié)合儀器專業(yè)的角度來看冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡技術(shù)其實在很多方面與我們儀器專業(yè)密切相關(guān)，比如說冷凍電鏡的一大優(yōu)點就是樣品臺穩(wěn)定，普通的電鏡穩(wěn)定工作臺需要10分鐘，而最好

9、的冷凍電鏡工作臺的穩(wěn)定時間已經(jīng)可以實現(xiàn)在20秒左右，效率至少是普通電鏡的30倍，如何設(shè)計這樣一種需要很快時間穩(wěn)定下來且精度要求很高的工作臺就是 我們儀器專業(yè)領(lǐng)域所要研究的問題，我們可以遵循粗精結(jié)合、基面合一、變形最小等基本的儀器設(shè)計原則對工作臺進行設(shè)計，在設(shè)計的過程當(dāng)中可以借助計算機軟件進行仿真，例如我們可以利用ANSYS軟件，運用有限元的思想仿真工作臺在受力情況下的變形程度以及計算 工作臺受外界擾動后再次達到穩(wěn)定所需的時間，優(yōu)化設(shè)計工作臺的設(shè)計參數(shù)。而對于冷凍電鏡自動換樣品、自動換氮、自動維持清潔功能的實現(xiàn)，結(jié)合我們儀器專業(yè)分析，自動化功能 的實現(xiàn)首先是需要設(shè)計一系列的傳動、運動系統(tǒng)，有了傳

10、動、運動系統(tǒng)的配合，儀器才可能完成一系列把樣品自動送出、送入，自動維持自身清潔等智能化的動作，如何設(shè)計出這樣一整套既能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能，又要保證整個儀器的工作可靠性的系統(tǒng)，是我們在儀器設(shè)計的時候需要認真去考慮的問題。 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計同樣也是儀器設(shè)計當(dāng)中一個重要的技術(shù)難點，對這些復(fù)雜、龐大的顯微儀器而言， 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計就顯得尤為重要。顯微儀器設(shè)計的目的就是為了幫助人們更好地去認識微觀世界，判斷顯微儀器的好壞最直接的方法就是看其成像的質(zhì)量，成像是否清晰，是否可以突破衍射極限，達到原子分辨率量級，而這又與光學(xué)有著直接的聯(lián)系。我們在設(shè)計儀器光路系統(tǒng)的時候，如何能夠?qū)崿F(xiàn)光路的最優(yōu)化，如何可以消除球差、慧

11、差、像差、畸變、色散等一系列的像差問題（借助專業(yè)的光學(xué)軟件Zemax、Code V等），如何選擇透鏡的面型 （結(jié)合透鏡的加工難度、價格等因素），如何盡可能用最少數(shù)量的透鏡達到光路的設(shè)計要求，如何在保證質(zhì)量要求的前提下盡可能減少系統(tǒng)的成本等等，這些都是我們在顯微儀器（包括冷凍電鏡這種高精尖儀器）光路系統(tǒng)設(shè)計過程當(dāng)中所要面臨的問題，都與我們平時所學(xué)習(xí)的儀器專業(yè)基礎(chǔ)知識緊密結(jié)合。冷凍電子顯微學(xué)從 20世紀中葉開始，經(jīng)歷了 80年代到90年代的技術(shù)方法建立時期， 21世紀初的技術(shù)成熟期，在過去的兩年里發(fā)生了革命性的技術(shù)進步，進入了快速發(fā)展期。結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究者如何抓住這個契機，如何盡快適應(yīng)新

12、的局面，掌握新的技術(shù)，充分發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢從而更加深入地研究生命現(xiàn)象，將是未來幾年里的一個主題。 冷凍電鏡技術(shù)是一個多學(xué)科交叉的技術(shù)，數(shù)學(xué)、物理學(xué)、計算機、材料、化學(xué)等自然科學(xué)將在未來 冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展中扮演重要的角色，未來冷凍電鏡是否能夠取代X射線晶體學(xué)，成為今后結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要工具，這一切都還是一個未知數(shù)。我國的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和儀器制造工作者應(yīng)該抓住冷凍電鏡所帶來的全新機遇，不斷縮小自身與世界先進水平的差距，努力贏得新技術(shù)變革所帶來的挑戰(zhàn)。親愛的用戶：1、只要朝著一個方向努力，一切都會變得得心應(yīng)手。20.6,286.28,202015:2415:24:26Jun-2015:24春妻春密畫刎新桃換恒符帝那桃花盛并28地方，在3、有勇氣承擔(dān)命運這才是英雄好漢。15:246.28.202015:246.28.202015:2415:24:266.28.202015:246.28.2020這醉火軻W坤節(jié)愿你嚏酒像春次554樣艷光，心情像桃5、閱讀使人充實，會談使人敏捷，寫作使人精確。Sunday, June 28, 2020June 2