關(guān)于血清的一些問題

1、實(shí)驗(yàn)室里常會(huì)遇到的關(guān)于血清的問題1.血清的運(yùn)用領(lǐng)域血清：離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體，即血清。血清可以抗病毒,增強(qiáng)抵抗力血清屬于生物制劑 .小牛血清含在離開母體后自身產(chǎn)生的一些代謝物質(zhì)，當(dāng)然也包括一些生長(zhǎng)激素，而胎牛血清絕大部分的物質(zhì)來自于母體。血液凝固析出的淡黃色透明液體。如將血液自血管內(nèi)抽出，放入試管中，不加抗凝劑，則凝血反應(yīng)被激活，血液迅速凝固，形成膠凍。凝血塊收縮，其周圍所析出之淡黃色透明液體即為血清，也可于凝血后經(jīng)離心取得。在凝血過程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原，這一點(diǎn)是與血漿最大的區(qū)別。而在凝血反應(yīng)中，血小板釋放出許多物質(zhì)，各凝血因子也都發(fā)生

2、了變化。這些成分都留在血清中并繼續(xù)發(fā)生變化，如凝血酶原變成凝血酶，并隨血清存放時(shí)間逐漸減少以至消失。這些也都是與血漿區(qū)別之處。但大量未參加凝血反應(yīng)的物質(zhì)則與血漿基本相同。為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。 血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的應(yīng)用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。1.血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選

3、擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。 牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，

4、其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是達(dá)到生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問題。主要是：第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類生長(zhǎng)因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來許多困難；第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連

5、續(xù)性受到限制；第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。3.血清主要作用： 提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。   提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。   提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。   提供促接觸

6、和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。   對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如SeO3,硒等2.保存血清最好的方法?我們建議血清應(yīng)保存在-5至-2O。然而，若存放于4時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至

7、恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。3.收到的血清部分或完全融化，該怎么辦？將FBS置于4°C或室溫使其完全融化，輕輕搖動(dòng)血清瓶使血清混合均勻后重新置于-20°C凍結(jié)，血清品質(zhì)不會(huì)收到影響。4.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎?一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。5.如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?我們建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在2-8時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋

8、白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。因此，推薦在-20以下儲(chǔ)存血清，并避免反復(fù)凍融。解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 請(qǐng)勿將血清置于37太久。若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。6.血清融化后含有沉淀，是怎么回事？該沉淀是血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）聚集形成的凝塊，這是血清的正常特性，不影響血清的品質(zhì)，可以靜置使其自行沉淀或離心后使用。7.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性，不會(huì)影響產(chǎn)品性質(zhì)。血清中沉

9、淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g,1-2分鐘稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過濾膜。 大多情況輕輕搖動(dòng)沉淀并加熱至37就會(huì)再溶解。所以，使用產(chǎn)品時(shí)要搖動(dòng)并加熱血清至37，沉淀會(huì)自然消失。8.血清瓶底有果凍樣物質(zhì)，如何處理？不當(dāng)?shù)难鍦缁畈僮鳎缁畹臏囟龋瑫r(shí)間以及溫度的均一性）會(huì)使

10、血清中的蛋白降解，在血清瓶底部聚集形成果凍樣成分。該血清不能繼續(xù)使用，建議丟棄。9.如何避免沉淀？按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生：(1)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。(2) 血清分裝凍存時(shí)，須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一。(3) 勿直接由-20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。(4) 勿將血清置于37太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成份也會(huì)因此受到破壞，從而影響血清的品質(zhì)。(5) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。(6) 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56，30分鐘的

11、原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。10.為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀?胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在28時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在20儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。 血清在貯存解凍過程中會(huì)產(chǎn)生沉淀，這是由于血清中含有大量脂蛋白、纖維蛋白及多肽類物質(zhì)，在-15冷凍保存解凍后就會(huì)自然形成沉淀，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，沉淀量會(huì)增加。因此在融化血清時(shí)一般應(yīng)先在4放置使之解凍，然后放在室溫使血清完全融化，以避免沉淀的增加。添加血清時(shí)應(yīng)避免把沉淀加入培養(yǎng)液

12、，否則由于沉淀的存在會(huì)使得所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大量黑點(diǎn)，或者細(xì)胞表面將會(huì)覆蓋一層油狀物質(zhì)，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。為減少血清的損失，可以把有沉淀的血清收集起來進(jìn)行離心處理，將上清液加入培養(yǎng)液使用（一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因?yàn)槌恋頃?huì)堵塞濾膜而無法過濾）。11.如何避免沉淀物的產(chǎn)生?我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作: 解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20至4至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20至37)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度

13、過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。12.伽馬射線輻照對(duì)于牛血清制品中各種病原微生物的滅活效果通常情況下，胎牛血清是采自無動(dòng)物疾病的牛群，經(jīng)過連續(xù)三次0.1 微米孔徑濾膜的除菌過濾后獲得，而小牛血清采用的是0.2 微米孔徑的濾膜過濾。病原微生物的檢測(cè)方法通常為酶聯(lián)法。但是僅僅經(jīng)由除菌過濾的牛血清在生物安全性方面，具有以下不足之處：a) 尺寸小于0.2微米（或0.1微米）的微生物，無法濾除；b) 酶聯(lián)法檢測(cè)結(jié)果陰性，不一定代表完全沒有病原微生物的存在；如果存在病原微生物但是沒有達(dá)到酶聯(lián)法檢測(cè)的靈敏度下限，同樣顯示為陰性結(jié)果；c) 其

14、他未知的病原微生物也可能存在（檢測(cè)種類以外的其他病原微生物）伽馬射線輻照在除菌過濾的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低了微量病原微生物的存在可能性，為牛血清的“清潔和安全”打上了雙保險(xiǎn)，符合各種生物制品的安全要求。輻照對(duì)于各種具有代表性的病原微生物的滅活效果統(tǒng)計(jì)，詳見下表（輻照劑量2535kGy）：名稱 種屬 微生物大小 滅活效果(對(duì)數(shù)減少量 Log reduction)大腸桿菌 革蘭氏陰性桿菌 1.5-4.0 um> 6短小芽孢桿菌 革蘭氏陽性桿菌, 芽孢 0.6-2.5 um> 6白色念珠菌 真菌(二相性) 2-3 um> 6Acholeplasma laidlawii支原體 0.3-0

15、.8 um> 8JH Strauss 噬菌體 24-26 nm1牛病毒性下痢病毒 披膜病毒單鏈RNA包膜病毒30-60 nm6牛副流感病毒3型 副粘液病毒單鏈RNA包膜病毒100-250 nm6牛傳染性鼻支氣管炎病毒皰疹病毒雙鏈DNA包膜病毒100 nm5牛藍(lán)舌病病毒 環(huán)狀病毒雙鏈DNA 60-80 nm> 3貓白血病病毒 逆轉(zhuǎn)錄酶病毒 100-120 nm> 3小鼠微小病毒 細(xì)小病毒單鏈DNA非包膜病毒 25 nm2豬細(xì)小病毒經(jīng)由伽馬輻照的牛血清產(chǎn)品，對(duì)比沒有經(jīng)過輻照的同一批號(hào)的牛血清產(chǎn)品，其促細(xì)胞生長(zhǎng)性能不受影響。SAFC Biosciences的 SER-TA

16、INTM伽馬輻照處理技術(shù)，是經(jīng)由美國(guó)FDA驗(yàn)證的技術(shù)，每個(gè)操作步驟都經(jīng)過嚴(yán)格驗(yàn)證（包裝方式、輻照劑量計(jì)算、輻照時(shí)間、溫度控制等環(huán)節(jié)），確保每一次、每一批的牛血清都經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的輻照處理，從而確保輻照效果的一致性和穩(wěn)定性。13.為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 14.有必要做熱滅活嗎?實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷?/p>

17、處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。常規(guī)滅活建議的溫度在45到62之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中最常用的手法是56熱處理30分鐘?？纯茨沭B(yǎng)的細(xì)胞是什么，一般的話估計(jì)問題不大，要是很珍貴的細(xì)胞還是慎重一點(diǎn)啊。熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì), 在對(duì)補(bǔ)體滅活以外，熱處理同時(shí)也對(duì)血清中可能存在的支原體具有滅活作用。若非必須，可以不需要做熱處理這一

18、步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量。此外，有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對(duì)細(xì)胞的促粘附作用。15.細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理？一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：(1)細(xì)胞生長(zhǎng)過老，破碎的細(xì)胞殘骸;(2)血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果;(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長(zhǎng);(4)

19、配制培養(yǎng)基的水質(zhì)、容器不合格?？蓱?yīng)用離心、過濾的方法去除這些黑點(diǎn);(5)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。16.細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止黑點(diǎn)？(1) 盡可能地減少血清凍融次數(shù)。(2) 培養(yǎng)基無需37水浴。(3) 培養(yǎng)基保持最佳PH值7.0- 7.2。(4) 嚴(yán)格控制配制培養(yǎng)基的水質(zhì)，容器定期刷洗。(5) 掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，細(xì)胞切勿生長(zhǎng)過老。17.融化后血清的顏色和之前用過的血清顏色不一致是什么原因？正常的血清顏色是澄清透明的琥珀色，不同批次的血清由于血紅蛋白含量的不同顏色會(huì)有深淺差異，顏色不會(huì)影響血清品質(zhì)。18.牛血清對(duì)細(xì)胞及病毒滴度的影響 血清是一種成分復(fù)雜

20、的混合物，不同批次血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不同。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1、細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，長(zhǎng)滿單層時(shí)間長(zhǎng)；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10的對(duì)照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時(shí)，會(huì)出現(xiàn)對(duì)照血清長(zhǎng)滿單層，而待檢血清大約只有6070，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。 2、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會(huì)變差；比如：細(xì)胞瓶里會(huì)出現(xiàn)一些蠕動(dòng)的小黑點(diǎn)（并非污染），或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆

21、粒填充，從而影響細(xì)胞向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)。 3、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子，會(huì)使細(xì)胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細(xì)胞會(huì)從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動(dòng)細(xì)胞瓶會(huì)看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動(dòng)。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞萎縮的情況越來越嚴(yán)重，直到最終完全脫壁而死亡。 4、細(xì)胞長(zhǎng)的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測(cè)幾乎測(cè)不出抗原滴度。這種情況也許是因?yàn)檠逯泻信c接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會(huì)存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會(huì)把接進(jìn)去的

22、病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會(huì)被抗體完全中和，就沒有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會(huì)檢測(cè)不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費(fèi)，浪費(fèi)人力、物力，尤其是時(shí)間上的浪費(fèi)，從培養(yǎng)細(xì)胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個(gè)月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時(shí)間就白白浪費(fèi)掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險(xiǎn)之一。 5、細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。這種情況比較常見，細(xì)胞是病毒的載體，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，病毒就無法進(jìn)行正常的復(fù)制。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價(jià)不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。19.牛血清給生物制品帶

23、來的問題 對(duì)于使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞來說，添加牛血清是必不可少的。但是牛血清的使用也給細(xì)胞培養(yǎng)和生物制品的生產(chǎn)帶來很多問題，并成為生物制品生產(chǎn)水平達(dá)到最優(yōu)化和實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)性目標(biāo)的一大障礙。 1、批間差異 血清是一種成分復(fù)雜而且不確定的混合物，不同來源的血清成分存在很大的差異，因此支持細(xì)胞生長(zhǎng)的效果也有較大差別。而每批血清的批量是有限的，所以換血清批號(hào)時(shí)要預(yù)先做大量的篩選實(shí)驗(yàn)，以確定對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響最小的血清。不但增加工作量,而且如果因?yàn)橐粫r(shí)篩選不出合適的血清還會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)停滯。 2、動(dòng)物來源成分 因?yàn)閬碓从趧?dòng)物,所以有可能攜帶傳染源,包括病毒和有毒物質(zhì),任何一種傳染源都有可能對(duì)正在生長(zhǎng)的細(xì)胞系

24、或者制品帶來風(fēng)險(xiǎn)；不同來源的血清存在某些特異性病毒抗體（比如：乙腦抗體、牛腹瀉性病毒抗體等），直接影響接毒后病毒的復(fù)制，可能導(dǎo)致不產(chǎn)毒或毒價(jià)偏低，從而給疫苗生產(chǎn)造成巨大損失。 3、提高生產(chǎn)成本 目前市場(chǎng)銷售的血清平均價(jià)格約0.25元/ml，按10添加量計(jì)算，1L培養(yǎng)液中血清所占的成本是25元，培養(yǎng)基及其他添加物的成本約為6元，每升培養(yǎng)液的成本中血清約占80，由此可見血清在疫苗生產(chǎn)中占據(jù)了大量的生產(chǎn)成本。 4、行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致質(zhì)量難以提高 由于國(guó)內(nèi)牛血清生產(chǎn)廠家增多，而用戶的數(shù)量有限。為了獲得客戶資源，很多血清廠家都在進(jìn)行低價(jià)銷售，行業(yè)內(nèi)形成一種惡性的價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)。低價(jià)格帶來的結(jié)果就是低質(zhì)量的血清。目前

25、很多血清廠家都處于維持生存的狀態(tài)，因此難以投入大量資金和人力來提高血清的質(zhì)量。 5、血清蛋白引起的疫苗純化問題 由于血清含有大量的不同分子量的未知蛋白和多肽類物質(zhì)，勢(shì)必會(huì)增加提取，分離，純化的步驟，增加了下游純化處理的難度，因此在疫苗純化階段給純化工作帶來很大的困難；疫苗產(chǎn)品中牛血清白蛋白殘留量要求不高于50ng/劑，為達(dá)到純化的目的，純化工藝不得不添加新的儀器設(shè)備；在除去牛血清白蛋白殘留的同時(shí)，也會(huì)損失大量的有效目的產(chǎn)物，從而降低了疫苗的產(chǎn)率；牛血清中的某些蛋白與目的產(chǎn)物的分子量接近，在純化過程中不能完全被去除，由于血清殘留而導(dǎo)致的生物制品不合格，或者因?yàn)殡s蛋白含量大造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的情況時(shí)

26、有出現(xiàn).因此也會(huì)嚴(yán)重影響疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。6、改變培養(yǎng)液的pH值 牛血清的pH理論值為7.08.0，培養(yǎng)基在加入規(guī)定量的碳酸氫鈉后（即達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的滲透壓），再加入10的牛血清，一般會(huì)使培養(yǎng)液的pH值發(fā)生改變。因此在使用過程中應(yīng)注意pH的變化，如有必要可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH到所需值。 7、由于血清的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，非常適合細(xì)菌、真菌和支原體等生長(zhǎng)。國(guó)產(chǎn)血清大部分采用手工分裝，因此容易把微生物帶入而使得血清被污染。使用前如果沒有及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將會(huì)把污染物帶入正在培養(yǎng)的細(xì)胞中，而使得細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)。 - 10 -如何判斷胎牛血清質(zhì)量一、外觀拿到血清，最先接觸的是血清

27、外觀，對(duì)于缺少細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的人來說，外觀的判斷尤為重要1、顏色根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，我國(guó)的細(xì)胞培養(yǎng)用血清標(biāo)準(zhǔn)是不高于20mg/dl，實(shí)際上，血紅蛋白含量的高低對(duì)血清并無直接影響，這個(gè)指標(biāo)的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范程度，良好的操作能降低血清的溶血。國(guó)產(chǎn)血清的采血點(diǎn)很分散，大多是由屠戶采血后馬上離心收集，所以很少會(huì)有溶血，表現(xiàn)出明亮的蠟黃色，當(dāng)然，國(guó)產(chǎn)血清也很少有標(biāo)準(zhǔn)意義上的胎牛血清。進(jìn)口胎牛血清或多或少總有點(diǎn)溶血，因?yàn)檎嬲奶ヅＱ迥δ懿睿t細(xì)胞容易破裂。總的來說，國(guó)產(chǎn)的血清呈現(xiàn)出蠟黃。進(jìn)口的血清，質(zhì)量最好的呈現(xiàn)出談黃、微紅色，如Gibco 16000

28、，差點(diǎn)的呈現(xiàn)出橘紅色或鮮紅色。當(dāng)然，熱滅活血清或保存不當(dāng)?shù)难澹捎谘t蛋白的破壞氧化，會(huì)呈現(xiàn)出暗紅，甚至咖啡色。2、沉淀很多血清客戶，會(huì)發(fā)現(xiàn)進(jìn)口血清有沉淀，從而懷疑血清的質(zhì)量問題，這是沒有根據(jù)的。血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生，對(duì)血清質(zhì)量沒有任何影響，沉淀的產(chǎn)生原因很多，和廠家的加工生產(chǎn)方式密切相關(guān)。國(guó)產(chǎn)的血清：大多來自北方，由于價(jià)格低廉，保存環(huán)境都不好，從采血、冷凍、運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)會(huì)經(jīng)過多次凍融，每次凍融過程，就會(huì)析出部分纖維蛋白沉淀，這樣，血清成品過濾后看起來反而更加的“干凈”，很少有沉淀產(chǎn)生。進(jìn)口的胎牛血清：過濾分裝前很少會(huì)反復(fù)凍融，生產(chǎn)后的成品也是清澈的，但隨著時(shí)間的推移，血清中的大

29、量纖維蛋白會(huì)析出形成沉淀。當(dāng)然，進(jìn)口的新生牛血清，一般牛齡都在2周左右，血清中的各種蛋白含量明顯偏高，生產(chǎn)后血清可能會(huì)渾濁，甚至有大量沉淀。當(dāng)然，購買回來的血清都是冰凍狀態(tài)，使用時(shí)需要融化，融化過程最好在溫度較低的狀態(tài)下慢慢進(jìn)行，否則沉淀相對(duì)較多，雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量，但對(duì)細(xì)胞的顯微觀察有一定的阻礙。3、澄清度進(jìn)口胎牛血清由于蛋白和脂類等物質(zhì)含量低，表現(xiàn)為稀薄、清淡，而國(guó)產(chǎn)血清，因?yàn)榻^大多數(shù)是新生牛血清，相對(duì)而言更加粘稠，顏色略深，這對(duì)于初步接觸血清的人很難判斷，但把兩者進(jìn)行對(duì)比，可容易分辨。二、主要技術(shù)指標(biāo)目前國(guó)內(nèi)血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是2005版的中華人民共和國(guó)藥典，主要指標(biāo)有以下幾點(diǎn)：

30、1、內(nèi)毒素國(guó)產(chǎn)血清標(biāo)準(zhǔn)為不高于5EU/ml。內(nèi)毒素是細(xì)菌破碎后細(xì)胞壁的成分，因此內(nèi)毒素含量的高低可表現(xiàn)出采血到生產(chǎn)一系列過程中的無菌操作情況。目前，國(guó)產(chǎn)血清基本都能達(dá)到這一要求，很多進(jìn)口胎牛血清內(nèi)毒素含量反而更高，如Gibco 26140，只要求不高于50EU/ml，高出我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)10倍，即使是16000，也要10EU/ml，血清質(zhì)量也未見影響?？梢?，內(nèi)毒素含量偏高不影響質(zhì)量，除非含量極高，預(yù)示著已經(jīng)污染。2、總蛋白含量胎牛血清一般范圍是30-40mg/ml，數(shù)值偏高，說明采血的牛齡偏大，不是胎牛，數(shù)值偏低，表明血清可能摻水了。3、血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)為不高于20mg/dl，顏色越紅，數(shù)值越高，反之，數(shù)

31、值越低。4、pH國(guó)產(chǎn)血清，大多高于7.5，進(jìn)口胎牛血清，大多低于7.5，具體原因未知，可能和牛齡有關(guān)，這也能用來初步鑒別血清的來源。5、微生物包括細(xì)菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等。隨著國(guó)內(nèi)血清廠家生產(chǎn)條件的改善提高，細(xì)菌、霉菌等“大型”微生物幾乎能100%控制，支原體經(jīng)過0.1um過濾，大多也能清除。大腸桿菌噬菌體的污染還是比較嚴(yán)重的，主要是生產(chǎn)環(huán)境過程中帶入，又無法過濾，很難徹底清除，但對(duì)血清質(zhì)量影響不大。病原性病毒，特別是BVDV，在國(guó)產(chǎn)血清中幾乎90%以上都存在，這類微生物是影響國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量的重要因素之一，而進(jìn)口胎牛血清中基本都控制的很好。6、免疫球蛋白國(guó)產(chǎn)血清的只是定性檢測(cè)

32、，結(jié)果也很不準(zhǔn)確，進(jìn)口胎牛血清大多定量檢測(cè)。免疫球蛋白的數(shù)值能完全體現(xiàn)出采血的時(shí)的牛齡情況，國(guó)產(chǎn)血清，基本都是新生牛的，血清中容易產(chǎn)生IgM，IgG的含量也偏高，進(jìn)口胎牛血清，不含IgM，IgG的含量也較低。7、其它不管是國(guó)產(chǎn)還是進(jìn)口血清，都是不測(cè)抗生素的（無四環(huán)素胎牛血清除外）。國(guó)外，抗生素的使用很嚴(yán)格，用量也很少，每頭奶牛的產(chǎn)品包括血清都可以溯源的，因此可以做到胎牛血清中不含抗生素或含量極低;國(guó)內(nèi)，抗生素的濫用已成了普遍現(xiàn)象，國(guó)產(chǎn)血清中殘留很高，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)極為不利，這是國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量差的根本原因。三、血源市場(chǎng)上的血清血源主要分為中國(guó)、北美、南美和澳洲。1、國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量差，這是公認(rèn)的，主要原因

33、并不是生產(chǎn)廠家的責(zé)任，而是天然環(huán)境差和抗生素的大量使用。國(guó)內(nèi)環(huán)境污染嚴(yán)重，同時(shí)飼養(yǎng)過程中抗生素極其濫用，有毒有害物質(zhì)會(huì)大量殘留在血清中，最終不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。2、南美血清，來源很多，如Bioind的巴拿馬、Gibco的烏拉圭、巴西等，這些血清由于采血的不可控性，質(zhì)量參差不齊，當(dāng)然，相對(duì)于國(guó)內(nèi)血清來說好的多。另外，國(guó)內(nèi)銷售的南美血清大多顏色鮮紅，如Bioind、Gibco、Hyclone等品牌，但阿根廷的血清例外，這可能和各國(guó)的采血、生產(chǎn)工藝有關(guān)。3、北美血清，主要來自美國(guó)和加拿大，如Hyclone的SH30396、SH30070、SH30071、Gibco的16000-044、26140-07

34、9等。這類血清，等級(jí)越高的顏色越淡，表現(xiàn)為淡黃中帶一點(diǎn)微紅，SH30070和SH30396對(duì)比就很明顯，特級(jí)胎牛血清基本就能進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)。北美血清還有一個(gè)顯著特點(diǎn)就是每瓶血清都能溯源，這對(duì)一些大型的疫苗廠、藥廠尤為重要。4、澳洲血清，來源主要是新西蘭和澳大利亞，這是在北美血清禁運(yùn)之后進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)的，一般不具有溯源功能，由于生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)仍?，價(jià)格相對(duì)來說比較貴。拿Gibco的10099和16000相比較，后者質(zhì)量等級(jí)更高，顏色更淡，性價(jià)比更高。四、牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能： 牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。 1、提供能促使細(xì)胞

35、指數(shù)生長(zhǎng)的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量微小的營(yíng)養(yǎng)物，以及某些低分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)； 2、提供結(jié)合蛋白，識(shí)別維生素、脂類、金屬離子，并與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用； 3、是細(xì)胞貼壁、鋪展生長(zhǎng)所需因子的來源； 4、起酸堿度緩沖液作用； 5、提供蛋白酶抑制劑，細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。五、牛血清的質(zhì)量要求 （一）WHO公布的用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程中的要求 1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家，并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。 2.有些國(guó)家還要求牛血清來自沒有用過反芻動(dòng)物蛋白飼料喂養(yǎng)的牛群。 3.要能證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。 4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。 5.無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國(guó)家要求無大腸桿菌噬菌體污染。 6.要求血清對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。（二）我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)最早在2000年版中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中提出。包括物理性狀、總蛋白，血紅蛋白、細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬