土霉素發(fā)酵工藝

1、生物產(chǎn)品工藝學(xué)結(jié)課論文1 引言生物工程產(chǎn)品工藝學(xué)課程設(shè)計，一方面要求綜合應(yīng)用生物、發(fā)酵工程、代謝控制發(fā)酵工程和CAD制圖等課程的理論知識，以掌握微生物發(fā)酵中常見的代謝控制方法、產(chǎn)品工藝的設(shè)計方法以及設(shè)計步驟，另一方面又要根據(jù)設(shè)計對象的具體特征，憑借設(shè)計者的經(jīng)驗（或者借鑒前人的經(jīng)驗），了解設(shè)計的訣竅，對設(shè)計參數(shù)等做合理的選擇和優(yōu)化，這往往成為設(shè)計能否成功的關(guān)鍵所在，也是設(shè)計區(qū)別于習(xí)題的重要方面。1.1 土霉素發(fā)展現(xiàn)狀在上世紀(jì)6070年代，土霉素曾經(jīng)在我國抗菌藥市場上占據(jù)著重要位置，但自80年代中后期起，土霉素的市場就開始逐漸下滑，大批企業(yè)先后放棄了生產(chǎn)。21世紀(jì)初，全國土霉素產(chǎn)量已從20世紀(jì)80

2、年代的2萬噸下降到12000噸，目前的產(chǎn)量已不到1萬噸，生產(chǎn)企業(yè)從幾十個減少到只有幾個。目前主要生產(chǎn)企業(yè)為石家莊華曙制藥、內(nèi)蒙古赤峰制藥、山西星火制藥等。其中石家莊華曙制藥的規(guī)模和產(chǎn)量最大，達(dá)6000噸左右，約占世界總產(chǎn)量的1/4。隨著土霉素產(chǎn)量的不斷下降，出口量也逐年減少，出口價格一路走低。1995年，我國土霉素出口價格為11.5美元/公斤，1998年為10美元/公斤，2000年已降到7美元/公斤。近年來，出口量和出口價格還在下滑。在國內(nèi)市場上，土霉素除了作為生產(chǎn)強力霉素等的原料外，主要用于畜禽藥物以及飼料添加劑，臨床用藥微乎其微。在發(fā)達(dá)國家，土霉素已基本不再使用，發(fā)達(dá)國家畜牧業(yè)中用的也是純

3、度高的無菌土霉素。我國生產(chǎn)的土霉素大部分為低檔產(chǎn)品，未來幾年出口形勢將十分嚴(yán)峻。1.2 土霉素的應(yīng)用（1）土霉素為四環(huán)類抗生素，生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)成本較低，可作為生產(chǎn)其它新型抗生素的原料。（2）土霉素價格低廉，可以作為飼料添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)。實踐表明：土霉素用于飼料添加劑，可以改善飼料轉(zhuǎn)化效率，促進畜禽生長，提高畜禽抗疾病能力。（3）土霉素是廣譜抗生素，對多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌作用。臨床上主要用于肺炎，敗血癥，斑疹，傷寒了，淋巴肉芽腫，砂巖及其他細(xì)菌性感染等，對傷寒有效，也可用于阿米巴痢疾和陰道滴蟲病患者。此外還能抑制立克次體和砂巖病毒及淋巴肉芽腫病毒 。2 土霉素及發(fā)酵微生物介

4、紹2.1 土霉素化學(xué)式及性狀土霉素又名氧四環(huán)素，化學(xué)名是：(4s,4R，5S，5R，6S，12S）-N-4-二甲胺基-1，4，4，5，5，6，11，12-八氫，5, 6，10，12，12- 六羥基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，為灰白色至黃色的結(jié)晶粉末，無臭，味苦，熔點是180，在空氣中性質(zhì)穩(wěn)定，在日光下顏色變暗在堿性溶液中易破壞失效。土霉素的鹽酸鹽為黃色結(jié)晶，味苦，熔點190194，有吸濕性，但水分和光線不影響其效價，在室溫下長期保存不變質(zhì)，不失效。鹽酸鹽易溶于水，溶于甲醇，微溶于無水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性條件下不穩(wěn)定。添加到飼料中，在室溫下保存四個月，效價下降4

5、%9%，制粒時效價下降5%7%1。土霉素化學(xué)式：C22H24N3O9，R=H，R'=CH3，R''=OH，齊結(jié)構(gòu)示意圖如圖1-1所示： 圖1-1 2.2 作用機理（1） 改變致病微生物的結(jié)構(gòu)和干擾其代謝過程，如阻礙細(xì)胞壁的合成，影響細(xì)胞黏膜的通透性，阻礙蛋白質(zhì)的合成，改變核酸代謝。（2） 能抑制動物腸道內(nèi)的有害微生物，激活大腸中有利于營養(yǎng)物質(zhì)合成的微生物。（3） 土霉素可使動物腸壁變薄，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而提高腸道吸收效率。2.3 發(fā)酵微生物土霉素是由龜裂鏈霉菌產(chǎn)生的，屬于放線菌中的鏈霉菌屬，他們具有良好的菌絲體，菌絲體分支，無隔膜，直徑約0.41.0米，

6、長短不一，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲之分，孢子絲再形成分生孢子。而龜裂鏈霉菌的菌落呈灰白色，后期生褶皺，成龜裂狀。菌絲成樹枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。3 土霉素生物合成的代謝調(diào)控土霉素屬于四環(huán)素類抗生素，是一大類廣譜抗生素，他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有二甲氨基，酰胺基，酚羥基和兩個含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)，即都含有氫化直駢四苯的基本結(jié)構(gòu)，具有共同的碳架。四環(huán)素類抗生素生物和成及調(diào)控過程中，起始的化合物是丙二酰胺輔酶A，它同8個丙二酰輔酶A分子重復(fù)縮合脫羧，形成一個直鏈化合物-多酮次甲基鏈，然后經(jīng)過重復(fù)閉環(huán)等反應(yīng)，形成四環(huán)素類抗生素。土霉素代謝調(diào)控機制的控制主要有磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、AT

7、P的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)等2。3.1 抗生素的生物合成與糖代謝途徑的關(guān)系在某些抗生素發(fā)酵過程中，不同時期的糖代謝途徑是不同的。從菌體生長期轉(zhuǎn)變?yōu)榭股胤置谄冢谴x途徑也發(fā)生變化，可見，抗生素的生物合成與糖代謝途徑有著一定關(guān)系。四環(huán)類抗生素這類聚酮體衍生物的合成，需要還原型輔酶（NADPH），而且NADPH還可能是限制因素，它的濃度大小決定體外醋酸鹽進入聚酮體或脂肪酸的數(shù)量。但是，NADPH又只是來自戊糖循環(huán)，該循環(huán)的酶活性的強弱直接影響NADPH的產(chǎn)量，因此，過量的磷酸鹽或通氣會嚴(yán)重干擾土霉素的合成，使產(chǎn)生NADPH的戊糖循環(huán)受阻。3.2 抗生素的生物合成與三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝的關(guān)系已知四環(huán)類抗生素

8、的碳架，是由乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A合成的。這些前體物質(zhì)是糖代謝的中間體或衍生物，凡是影響合成抗生素的前體物質(zhì)形成的反應(yīng)，都會影響抗生素的生物合成。有些前體物質(zhì)，不僅可供合成抗生素之用，還可進入三羧酸循環(huán)等初級代謝途徑而被消耗。乙酰輔酶A既可與草酰乙酸反應(yīng)形成檸檬酸，然后進入三羧酸循環(huán)而被氧化，又可以形成脂肪酸和聚酮體，因此成為代謝途徑中的三岔路口，隨著菌體代謝機能的差異而調(diào)節(jié)它的代謝途徑。還原型輔酶（NADPH）的不足可能是產(chǎn)生菌選擇合成四環(huán)素的途徑和停止合成脂肪酸的主要原因。因此，從能量的觀點來看，利用丙二酸單位來合成土霉素，對產(chǎn)生菌是有利的。3.3 抗生素生物合成與生物能量的關(guān)系目前認(rèn)為

9、，細(xì)胞的ATP（或EC）很可能是控制抗生素合成基因表達(dá)的一種效應(yīng)劑，低水平的ATP可能是發(fā)酵單位的標(biāo)志，高水平的ATP可能抑制抗生素的形成。3.4 抗生素發(fā)酵的代謝調(diào)控圖（見附圖1）4 土霉素發(fā)酵工藝4.1 菌種的選育與制備用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)抗生素，首先要有一個性能良好的菌種，從自然分離的野生菌種由于生產(chǎn)能力低，往往不能滿足工業(yè)上的需求。所以工業(yè)上常用的菌種都是經(jīng)過人工選育，具備工業(yè)生產(chǎn)要求，性能優(yōu)良的菌種。本設(shè)計中，土霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌株為龜裂鏈霉菌，屬放線菌。4.1.1 標(biāo)本采集土壤是微生物聚集最豐富的場所，菜園和農(nóng)田耗作層土壤含有豐富的有機物常以細(xì)菌和放線菌居多。采土?xí)r先用小鏟除去表土，取

10、515cm深處的土樣，選好35點，每點取土10g混在一起裝入滅過菌的牛皮紙袋，并記錄時間、地點、植被等情況，以備考察3。4.1.2 標(biāo)本的預(yù)處理由于土霉素產(chǎn)生菌龜裂鏈霉菌屬放線菌中的鏈霉菌屬，又由于放線菌的孢子（如鏈霉菌）更加耐熱，所以常采用熱處理方法減少材料中的細(xì)菌數(shù)。取到的菌樣在用土壤、根土組成的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。要求：9cm直徑平皿培養(yǎng)，加入3545ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度在100培養(yǎng)1h或40培養(yǎng)26h。待培養(yǎng)基上長出菌落后，依據(jù)龜裂鏈霉菌菌落外觀標(biāo)準(zhǔn)判斷。龜裂鏈霉菌菌落外觀：菌落較小而致密，不易挑取，菌落呈皺狀裂紋。孢子絲初旋至螺旋形。孢子長圓形至柱形，表面光滑。 由此可斷定為龜裂鏈霉

11、菌。4.1.3 所需菌種的分離篩選抗生素生產(chǎn)菌的方法包括抑菌圈法、稀釋法、擴散法、生物自顯影法等。本設(shè)計采用稀釋法，稀釋法又可分為液體稀釋法和固體稀釋平板傾注法。這里采用后者。先將待分離的材料作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1: 10000)，然后分別取不同稀釋度的溶液少許，與已熔化并冷卻至45的瓊脂培養(yǎng)基相混合搖勻后，倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，平皿上可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細(xì)菌或微生物繁殖而成的，隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。4.1.4 菌種的培養(yǎng)以麩皮、瓊脂作為天然培養(yǎng)

12、基，在37保溫箱中培養(yǎng)，至培養(yǎng)基中部分出現(xiàn)成熟顏色即可進行保藏。4.2 誘變育種從自然環(huán)境中分離的菌種的生產(chǎn)能力有限，一般不能滿足生產(chǎn)的實際需要。誘變育種是提高菌種的生產(chǎn)能力，使所需要的某一特性的代謝產(chǎn)物過量積累的有效方法之一。誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，一般包括誘變和篩選兩個部分，誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復(fù)，直到獲得高產(chǎn)菌株。4.2.1 出發(fā)菌株的選擇用來進行誘變的出發(fā)菌株的性能對提高誘變效果和效率十分重要，誘變出發(fā)菌株要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。由于野生型菌株生產(chǎn)性能較差，通常采用經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株，這樣的菌株隊誘變劑的敏感性會有所提高。4.2.2 菌懸液的制備在誘變育種

13、中，所處理的細(xì)胞必須是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長出不純菌落。由于在許多微生物的細(xì)胞內(nèi)同時含有幾個核，所以即使用單細(xì)胞懸浮液處理，還是容易出現(xiàn)不純的菌落。有時，雖然處理的是 單核的細(xì)胞或孢子，但由于誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變無法反映在當(dāng)代的表型上。由于上述原因，故在誘變霉菌或放線菌時，應(yīng)處理它們的孢子。在實際工作中，要得到均勻分散的細(xì)胞懸液，通常可用無菌的玻璃珠震蕩5min，來打散成團的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過濾，得到分散菌株。菌懸液介質(zhì)一般用生理鹽水。4.2.3 誘變劑處理誘變包括物理、化學(xué)、生物誘變，本設(shè)計利用物理誘變，方法

14、及步驟如下：紫外線誘變處理：將制備好的菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，置波長為253.7nm，15W的紫外燈下60cm處開蓋，進行振蕩照射。4.2.4 突變菌株的篩選誘變處理后，正向突變的菌株通常為少數(shù)，需進行大量的篩選才能獲得高產(chǎn)菌株。在抗生素生產(chǎn)菌的選育中，應(yīng)篩選抗生素抗性突變株。初篩：選用適合于抗生素產(chǎn)生菌的抑制圈法進行初篩。待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì)，或能分泌某種酶并將無毒的物質(zhì)水解成對工具菌有毒的物質(zhì)，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。方法：將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養(yǎng)基平皿，繼續(xù)培養(yǎng)45天，使抑制物積累，此時的

15、抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入涂布有工具菌的平板，每個瓊脂塊中心間隔距離為2厘米，培養(yǎng)過夜后，即會出現(xiàn)抑菌圈。抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。選擇抑制圈大的菌落接入斜面?zhèn)溆?。?fù)篩：將經(jīng)過初篩后的少數(shù)菌株接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)13小時后，接種于錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進行往復(fù)式搖床震蕩培養(yǎng)，即得到藥瓶種子。4.3 菌種保藏菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、沙土管干燥保藏法、甘油封藏法、真空冷凍干燥法等4。本設(shè)計采用砂土管干燥保藏法，這種保藏法適用于產(chǎn)生孢子的真絲狀真菌和放線菌，或形成芽孢的細(xì)菌。4.3.1 保藏原理及沙土管制備方法沙土管干燥保藏法的原理是造成干燥的寡營養(yǎng)條的

16、保藏條件。制備方法：首先將沙和土分別洗凈烘干并過篩（一般沙用80目過篩，土用100目過篩），按沙與土比例12：1混合均勻，分裝于小試管中，分裝高度約為1cm左右，121高壓間歇滅菌23次，無菌實驗合格后烘干備用。4.3.2 保藏方法和操作步驟方法：將需保藏的菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)后用無菌水制成孢子懸液，加入經(jīng)滅菌處理的沙和土的混合物（或純沙亦可）作為載體，減壓抽去水分，這些吸附有孢子的干燥沙土載體，在低溫下保存。操作步驟：斜面孢子先加滅菌蒸餾水22.5ml，沿斜面輕刮孢子后，再吸0.20.3 ml到滅菌備用的沙土管中，在真空度100 Pa以下進行干燥，直至沙土管外貌呈松散狀態(tài)，然后低溫（4）保存。經(jīng)真

17、空干燥后的沙土管，最好放在密閉容器內(nèi)，一般保存期為兩年左右5。4.4 培養(yǎng)基的配置微生物生長、繁殖、代謝和產(chǎn)物合成都需要營養(yǎng)，人工配置的培養(yǎng)基可以為微生物提供所必須的營養(yǎng)，除此之外，培養(yǎng)基還為微生物的生長提供必要的生長環(huán)境。培養(yǎng)基按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。4.4.1 孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基配置的目的是供菌種繁殖孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基。對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長迅速,產(chǎn)生數(shù)量多而且優(yōu)質(zhì)的孢子,并且不會引起菌體變異。培養(yǎng)基的營養(yǎng)不要太豐富，特別是有機氮源要低一些，否則孢子不易形成。無機鹽的濃度要適當(dāng),否則會影響孢子的顏色和數(shù)量。應(yīng)注意培養(yǎng)基的pH值和濕度。4.4

18、.2 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基時供孢子發(fā)芽、生長和菌體繁殖的。這類培養(yǎng)基碳源應(yīng)該提供速效碳源如葡萄糖等；氮源也要提供一些易于利用的；磷酸鹽的濃度可以適當(dāng)高一些；總之要相對豐富、完全、并要考慮能夠維持穩(wěn)定的pH值。最后一級種子培養(yǎng)基的成分應(yīng)該較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，以便種子進入發(fā)酵培養(yǎng)基后，能迅速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。4.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基既要有利于生長繁殖，防止菌體過早衰老，又要有利于產(chǎn)物的大量合成。要求培養(yǎng)基的組成應(yīng)豐富、完全，碳、氮源要注意速效和遲效的互相搭配，少用速效營養(yǎng)，多加遲效營養(yǎng)，還要考慮適當(dāng)?shù)奶嫉?，加緩沖劑穩(wěn)定pH值；并且還要有菌體生長所需的生長因子和產(chǎn)物合成所需的元素、前體和促進劑等

19、。4.5 培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求4.6.1 水 水是一切生物生存的基本條件，是所有培養(yǎng)基的主要成分，也是微生物機體的重要組成成分。水是良好的溶劑，又是活細(xì)胞中一切代謝反應(yīng)的媒介物，還可以維持細(xì)胞中的滲透壓，同時，水的比熱高，又是熱的良導(dǎo)體，能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱量，使細(xì)胞溫度不致于驟然升高，能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的溫度。4.5.2 碳源 凡能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素(碳架)的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳源。碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，又是產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)的重要原料。抗生素發(fā)酵中可選用葡萄糖做為碳源。4.5.3 氮源氮源是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，酶自身即為蛋白質(zhì)。因此，氮源是必不可少的重要原

20、料。常用的有機氮源油花生餅粉、豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。抗生素發(fā)酵中多選用玉米漿和黃豆餅粉作為氮源，其中含有的磷酸肌醇對土霉素的生產(chǎn)有積極的促進作用。發(fā)酵補料過程中選擇用于輔助氮源的氨水。4.5.4 無機鹽類及微量元素各種微生物在生長繁殖和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物中，需要磷、鎂、硫、鐵、鉀等無機鹽和微量元素作為酶的激活劑、生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)劑。在土霉素發(fā)酵中，很容易受到磷濃度的影響，很多此生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生多受磷酸鹽濃度的影響，必須嚴(yán)格控制。土霉素發(fā)酵中，選用碳酸鈣為原料來提供無機鹽和微量元素。4.5.5生長因子和促進劑

21、酶的生產(chǎn)中所需的生長因子大多由天然原料提供。玉米漿、麥芽汁、豆芽汁和酵母等，含有豐富的生長因子。促進劑是一類刺激因子，它們并不是前體或營養(yǎng)，這類物質(zhì)加入或可以影響微生物的正常代謝，或促進中間代謝產(chǎn)物的積累，或提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量6。4.6 龜裂鏈霉菌培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件斜面孢子培養(yǎng)基：麩皮85%，瓊脂15%，水100%種子培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO40.592，黃豆餅粉16.5，葡萄糖4.93，碳酸鈣0.15，硝酸鉀0.15，玉米油0.236，油酸甘油酯4.02，豆油9.045，硅油0.021。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO41.63，黃豆餅粉45.30，葡萄糖16.42，碳酸鈣0.15，

22、硝酸鉀0.15，玉米油0.79，油酸甘油酯3.42，豆油7.53，硅油0.056。發(fā)酵培養(yǎng)基補料(g/L)：油酸甘油酯16.571，豆油19.333，氨水（26%）12.2646。所有培養(yǎng)基都在121，0.1MPa滅菌30min。酸性蛋白酶生產(chǎn)中，種子培養(yǎng)初始溫度控制在30ºC左右；發(fā)酵全程31-30ºC分段培養(yǎng)。發(fā)酵周期為190h。4.7 種子擴大培養(yǎng)及孢子制備4.7.1 種子擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。本發(fā)酵屬于二級種子罐擴大培養(yǎng)，三級發(fā)

23、酵。設(shè)計流程如下：孢子種子斜面孢子種子搖瓶一級種子罐二級種子罐發(fā)酵罐4.7.2 制備母液斜面孢子將保存在冷凍干燥管中的土霉素生產(chǎn)菌，在無菌室超凈工作臺上接種于已滅菌的斜面培養(yǎng)基上，于 3536培養(yǎng)，取出放入冰箱（26）保存?zhèn)溆谩?4.7.3 制備子瓶斜面孢子將生長好且在冰箱存放一周以上的母瓶取出，制成菌懸液接種于子瓶斜面上，于 3536恒溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)好的子斜面，測搖瓶效價合格后保存在26冰箱中備用。 4.7.4 種子搖瓶一段時間后，將孢子用無菌水移接到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在3437下靜置培養(yǎng)40h，待長出大量孢子后，將其孢懸液接入一級種子罐內(nèi)進行擴大培養(yǎng)7。4.8 發(fā)酵工藝控制微生物發(fā)

24、酵生產(chǎn)中，必須研究生產(chǎn)菌種的最佳發(fā)酵工藝，如營養(yǎng)要求、培養(yǎng)溫度、pH條件、對氧的需求等，據(jù)此設(shè)計合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳的產(chǎn)物合成條件下，才能取得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的效果。4.8.1 發(fā)酵過程中溫度的影響及控制對微生物發(fā)酵來說，溫度的影響是多方面的，可以影響各種發(fā)酵條件，最終影響微生物的生長和產(chǎn)物形成。在抗生素發(fā)酵中，細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物積累的最適溫度往往不同。在生長初期，抗生素還未開始合成，菌絲體濃度很低時，以促進菌絲體迅速生長繁殖為目的時，應(yīng)該選擇適于菌絲體生長的溫度當(dāng)菌絲體濃度達(dá)到一定程度，到了抗生素分泌期時，此時生物合成成為主要方面，就應(yīng)該滿足生物合成的最適溫度，這樣才能促進 抗生素的大

25、量合成。在土霉素發(fā)酵中，采用變溫控制，種子培養(yǎng)初始溫度控制在35±1ºC，發(fā)酵階段發(fā)酵溫度控制在3234ºC，在中后期保持較低的溫度，以延長抗生素的分泌期，放罐前24h提高23ºC培養(yǎng)，能使發(fā)酵單位提高8。4.8.2 發(fā)酵過程中pH的影響及控制微生物生長和生物合成都有其最適和能夠耐受的pH范圍，放線菌生長的最適pH范圍是78，土霉素發(fā)酵用菌種龜裂鏈霉菌的生長繁殖階段的最適pH范圍與產(chǎn)物形成階段的最適pH范圍是不一致的。其菌體生長最適pH范圍：6.06.6，產(chǎn)物形成最適pH范圍：5.86.1。當(dāng)接種后發(fā)酵pH低于6.4時就可以開始通氨，通氨量的多少參考pH

26、值，要求100小時前pH在6.3-6.5，100小時候pH在6.2-6.3，放罐前8小時停止通氨。一般情況下，培養(yǎng)基成分中(C/N)高，發(fā)酵液傾于酸性，pH低；(C/N)低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH與通氣量的關(guān)系是：通氣量大，糖、脂得到完全氧化，最后產(chǎn)物為CO2和H2O；如果通氣量不足，糖、脂不完全氧化，則產(chǎn)物為中間產(chǎn)物有機酸，這些使培養(yǎng)基pH會不同程度的降低。不同鹽的利用對pH也會產(chǎn)生影響，如（NH4）2SO4的被利用則pH下降；而一些生理堿性鹽（如NaNO3）的酸根被利用則導(dǎo)致發(fā)酵液pH上升；在碳源嚴(yán)重不足，微生物被迫利用氨基酸的碳架，留下NH3，pH亦可能上升。pH的這些變化情況，

27、常常引起細(xì)胞生長和生產(chǎn)環(huán)境的變化，對生產(chǎn)帶來不利影響。因此生產(chǎn)中常采用一些pH的控制方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH，保持一定的(C/N)；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時，通過氮調(diào)節(jié)。4.8.3 發(fā)酵過程中CO2的影響及控制CO2是微生物的代謝產(chǎn)物，同時也是某些合成代謝的一種基質(zhì)，它是細(xì)胞代謝的重要指示。溶解在發(fā)酵液中CO2的對氨基酸、抗生素等微生物發(fā)酵具有刺激或抑制作用。土霉素發(fā)酵中，需要控制一個最佳的CO2分壓，才能獲得最高產(chǎn)量?？梢酝ㄟ^提高通氣量和攪拌速率，在調(diào)節(jié)溶解氧的同時，還可以調(diào)節(jié)CO2的濃度

28、，通氣使溶解氧保持在臨界值以上，CO2又可隨著廢棄排出，使其維持在引起抑制作用的濃度之下；降低通氣量和攪拌速率，有利于提高CO2在發(fā)酵液中的濃度。4.8.4 發(fā)酵過程中溶氧的影響及控制發(fā)酵中可以改變通風(fēng)量和攪拌速率，來實現(xiàn)對溶氧的控制。（1）通風(fēng)量的影響：發(fā)酵過程中，通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然年輕細(xì)胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通氣量可以少些；菌體生長繁殖旺盛時期，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；生產(chǎn)旺盛時的通風(fēng)量因菌種和酶種而定，一般需要強烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量的過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從

29、而影響酶的產(chǎn)量。用于土霉素生產(chǎn)的微生物龜裂鏈霉菌為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表進行控制。土霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，通氣比應(yīng)控制在1:0.8-1.0vvm。（2）攪拌的影響：對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶解氧，增加空氣用量。當(dāng)攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生切應(yīng)力，易使細(xì)胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，容易使發(fā)酵溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液粘度有關(guān)。土霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速可根據(jù)發(fā)酵

30、不同階段的需要進行調(diào)整，使溶解氧不低于飽和溶解氧濃度的30%。4.8.5 發(fā)酵過程中泡沫的影響及控制在微生物好氣培養(yǎng)中，發(fā)酵液為往往產(chǎn)生許多泡沫，這是正?，F(xiàn)象。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響添料，也容易使發(fā)酵液溢出罐外。因此，生產(chǎn)上必須采取消泡措施。消除可控制泡沫的方法主要包括機械消沫和消沫劑消沫兩大類。機械消沫是利用物理作用，靠機械的強烈振動或壓力的變化促使泡沫破碎；消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵（聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘有醚）。理想的消泡劑，其

31、表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難容于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。土霉素發(fā)酵中，一般隨著菌體生長繁殖旺盛和抗生素的積累而泡沫上升，因此消泡應(yīng)視具體情況而定。4.8.6 發(fā)酵過程中染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品的質(zhì)和量，重則倒罐或停產(chǎn)，影響工廠效益。因此要嚴(yán)格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設(shè)備，操作要慎重，設(shè)備滅菌要徹底。若在前期染菌，應(yīng)重新滅菌；中期染菌，應(yīng)偏離雜菌生長條件；后期染菌，可提前或及時放罐。 4.9 發(fā)酵工藝流程圖（見附圖2）5 土霉素提取工藝5.1 發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離預(yù)處理目的是將難溶于水的高價金屬離子螯合物溶解，使土霉素以鹽的形式溶解到發(fā)酵液中。

32、5.1.1 酸化（1） 酸化過程：酸化過程常采用草酸酸化，使菌絲中的土霉素釋放出來并生成溶于水的鹽，并且能析出草酸鈣沉淀，從而除去發(fā)酵液中的鈣離子，同時草酸鈣能促進蛋白質(zhì)的凝結(jié)，從而提高濾液的質(zhì)量。另外，草酸屬于弱酸，其對設(shè)備的腐蝕性要比硫酸、鹽酸好。（2） pH的控制：加入草酸的目的是釋放菌絲中的單位，同時要保證土霉素的穩(wěn)定性、成品的質(zhì)量和提煉成本。目前，工業(yè)提煉的pH控制在1.62.0范圍內(nèi)，pH過高對單位的釋放不利，pH過低會影響產(chǎn)品的質(zhì)量，同時增加產(chǎn)品的成本9。（3） 發(fā)酵液的去雜：發(fā)酵中存在著許多有機和無機的物質(zhì)，加入凈化劑除去鐵離子和蛋白質(zhì)。去雜過程采用的凈化劑是黃血鹽和硫酸鋅，利用二者的協(xié)同效應(yīng)除去蛋白質(zhì)，同時除去鐵離子。5.1.2 稀釋將發(fā)酵液進行適當(dāng)?shù)南♂?，一般稀?3倍，有利于過濾和脫色過程。5.1.3 過濾發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后可以通過板框過濾機進行過濾，實現(xiàn)固-液分離。工業(yè)上采用低單位濾液和草酸水洗濾餅以提高收率。5.2 脫色與結(jié)晶采用122-2樹脂對濾液進行脫色，其原理是利用122-2樹脂為陽離子交換樹脂，處理為氫型樹脂后，所帶的氫離子與色素蛋白中的氮、氧形成氫鍵，