KIR-HLA基因多態(tài)性與散發(fā)性急性戊型肝炎的關(guān)系

1、KIR-HLA基因多態(tài)性與散發(fā)性急性戊型肝炎的關(guān)系陳 沖1,2， 章樹業(yè)2， 荀靜娜2， 張玉玲2， 李微霞2， 盧 川2， 陳 良1,2(1 溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325000； 2 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心， 上海 201508)摘要：目的 探討殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)及其配體人類白細(xì)胞抗原(HLA)的基因多態(tài)性與散發(fā)性急性戊型肝炎(AHE)的相關(guān)性。方法 收集2015年8月-2016年9月期間于復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，另招募健康受試者30例作為對(duì)照組。提取入組對(duì)象外周血基因組DNA，采用序列特異性引物PCR法擴(kuò)增KIR基因，并利

2、用Sanger測(cè)序法對(duì)HLA進(jìn)行基因分型，分析KIR-HLA分布與散發(fā)性AHE的關(guān)系。計(jì)數(shù)資料組間比較采用2檢驗(yàn)。結(jié)果 兩組均可檢測(cè)到16種KIR基因(包括抑制型受體基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受體基因2DS1-5、3DS1，較特殊的抑制型/激活型受體基因2DL4，內(nèi)參基因DRB1及假基因2DP1)，同時(shí)HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可檢測(cè)。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出現(xiàn)的頻率顯著低于對(duì)照組(64.3% vs 9

3、3.3%, P<0.05; 23.8% vs 56.7%, P<0.05; 71.4% vs 100%, P<0.05; 69.0% vs 100%, P<0.05)；AHE患者HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因的出現(xiàn)頻率低于對(duì)照組(19.0% vs 40.0%, P<0.05；45.2% vs 73.3%, P<0.05)；另外，AHE患者中HLA-C1/C1基因出現(xiàn)的頻率高于對(duì)照組(71.4% vs 46.7%, P<0.05)。結(jié)論 抑制型基因KIR 2DL3/2

4、DL5/3DL2/3DL3，HLA-C1/C1、C1/C2和3DL1/HLA-Bw4的基因分布差異可能與HEV感染導(dǎo)致散發(fā)性AHE有一定關(guān)系。關(guān)鍵詞：肝炎, 戊型； 多態(tài)性, 單核苷酸； 受體, 自然殺傷細(xì)胞； HLA抗原； 基因型急性戊型肝炎(acute hepatitis E，AHE)是由HEV感染引起的急性自限性疾病，主要通過被污染的水和食物經(jīng)消化道傳播。全球既往HEV感染率為8%20%1-2，但感染發(fā)病群體僅占既往感染者非常小的一部分，大多數(shù)HEV感染者并未表現(xiàn)出急性肝炎癥狀3，其自身機(jī)體是否存在某些免疫學(xué)特征導(dǎo)致急性肝炎的發(fā)生有待進(jìn)一步研究。自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)為天然免疫系統(tǒng)的關(guān)

5、鍵組成部分，也是獲得性細(xì)胞免疫的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞，其可產(chǎn)生細(xì)胞因子和發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，在感染的早期控制病毒使其感染局限，亦可介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)4。NK細(xì)胞的激活是一個(gè)復(fù)雜的平衡過程，有賴于細(xì)胞表面激活與抑制相關(guān)受體之間相互調(diào)節(jié)，殺傷性免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIR)作為NK細(xì)胞主要受體之一，在參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能方面起著非常重要的作用，與KIR結(jié)合的配體主要是人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，多種抑制型和活化型KIR與HLA結(jié)合，傳遞抑制或激活信號(hào)，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性5。近年來KI

6、R基因多態(tài)性與病毒感染免疫相關(guān)的報(bào)道日益增多，包括HIV、HBV、HCV、EB病毒等6，然而HEV與KIR-HLA基因多態(tài)性的研究則較少報(bào)道，本研究旨在探討KIR-HLA基因多態(tài)性與散發(fā)性AHE的關(guān)系。1 資料與方法1.1 研究對(duì)象 收集2015年8月-2016年9月于復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，其中男31例，女11例，年齡2449歲，平均32歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：肝酶升高，血清膽紅素升高以及ELISA測(cè)定抗-HEV IgM陽性。另招募健康志愿者30例，其中男21例，女9例，年齡2543歲，平均30歲。本研究患者及健康志愿者均簽署知情同意書。1.2 樣本采集 留取AHE

7、患者及健康志愿者靜脈血5 ml，于-80 保存待測(cè)。1.3 主要試劑和儀器 血液基因組DNA小量提取試劑盒(DK601，上海萊楓生物科技有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(DYQ6072，杭州博日科技有限公司)，水平電泳儀(DYY-6D型，北京六一生物科技有限公司)，紫外/凝膠成像系統(tǒng)(NJ-206，上海馳唐儀器)，3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems, 美國(guó))。1.4 檢測(cè)方法1.4.1 外周血基因組DNA提取 血液樣本在室溫25 解凍，采用細(xì)胞裂解法從全血中快速提取樣本的基因組DNA。1.4.2 KIR基因分型 采用序列特異性引物PCR法擴(kuò)增目的片段。特異性引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)7

8、(引物由蘇州金唯智公司合成)，PCR試劑盒(TaKaRa公司)程序設(shè)置：94 3 min；5個(gè)循環(huán)：94 15 s，65 15 s，72 30 s；21個(gè)循環(huán)：94 15 s，60 15 s，72 30 s；4個(gè)循環(huán)：94 15 s，55 1 min，72 2 min；72 7 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)由3%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外/凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，根據(jù)條帶結(jié)果判定相應(yīng)的基因。KIR的AA或Bx單倍體判別在1.4.3 HLA基因分型 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀分析HLA基因分型，將特定的熒光標(biāo)記在引物上配制反應(yīng)Mix，并設(shè)置陰性對(duì)照，通過PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度大小檢測(cè)基因。HLA-B和C型單倍體的確

9、定在SBTengine 3.10.0.2610軟件中分析得到。比較兩組KIR基因位點(diǎn)的基因頻率有無差異，KIR基因表型頻率的計(jì)算采用陽性頻數(shù)計(jì)算法。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 兩組KIR及HLA基因分型頻率 兩組均可檢測(cè)到16種KIR基因(包括抑制型受體基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受體基因2DS1-5、3DS1，較特殊的抑制型/激活型受體基因2DL4，內(nèi)參基因DRB1及假基因2DP1)(表1)，同時(shí)HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4

10、/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可檢測(cè)(表2)。健康志愿者的假基因2DP1以及大部分基因片段2DL1/2DL3/2DL5/3DL1/3DL2/3DL3/2DS1/2DS2/2DS3/2DS4/2DS5/3DS1與我國(guó)人群KIR相關(guān)分型頻率相對(duì)一致，但部分基因的出現(xiàn)頻率如2DL2/2DL4存在較大范圍的偏離。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出現(xiàn)的頻率顯著低于健康對(duì)照組(64.3% vs 93.3%, P<0.05; 23.8% vs 56.7%, P<0.05; 71.4

11、% vs 100%, P<0.05; 69.0% vs 100%, P<0.05)(表1)。2.2 AHE與健康對(duì)照組KIR-HLA配體組合比較 AHE患者HLA-C1/C1基因出現(xiàn)頻率高于健康對(duì)照組(P=0.034)；HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因出現(xiàn)頻率低于健康對(duì)照組(P值分別為0.031、0.018)。其余KIR基因位點(diǎn)基因及配體結(jié)合頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。表1 兩組KIR基因表達(dá)頻率比較例(%)注：OR，比值比；95%CI，95%可信區(qū)間表2 兩組HLA分布和KIR-HLA配體組合比較例(%)3 討論N

12、K細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)受多種激活型與抑制型受體調(diào)控，表面受體KIR及其配體HLA的相互作用在調(diào)控NK細(xì)胞抵抗病毒感染的免疫功能上起著至關(guān)重要的作用5-6。HLA是人類主要組織相容性復(fù)合體 類分子，其最著名的功能是遞呈胞內(nèi)小肽給CD8+T淋巴細(xì)胞，而另一個(gè)作用則是作為KIR識(shí)別的受體。由于KIR基因的數(shù)量變異、序列多樣性、體內(nèi)表達(dá)多樣以及KIR-HLA結(jié)合多態(tài)性，使得KIR-HLA系統(tǒng)復(fù)雜多變8，均可能影響HEV感染機(jī)體時(shí)的免疫反應(yīng)。本研究中KIR-HLA基因分析結(jié)果顯示，HLA-C1/C1與HLA-C1/C2在AHE患者中出現(xiàn)的頻率高于健康對(duì)照組，提示高表達(dá)的HLA-C可能與散發(fā)性AHE有一定關(guān)系

13、。已有研究9表明，HLA-C基因的高表達(dá)有利于機(jī)體控制HIV感染，通過提高特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)HIV的應(yīng)答來減緩獲得性免疫缺陷綜合癥患者的病程進(jìn)展，尤其是HLA-C1/C1與KIR 2DL3存在時(shí)，NK細(xì)胞分泌的干擾素會(huì)顯著增多，使機(jī)體抵抗病毒感染的能力增強(qiáng)。不僅如此，Khakoo等10對(duì)HCV感染者KIR-HLA基因組合進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KIR 2DL3/HLA-C1基因組合有利于病毒的清除。以上研究的對(duì)象為HIV、HCV感染者，鑒于NK細(xì)胞在多種感染性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病發(fā)病及進(jìn)展等方面均有重要作用且機(jī)制復(fù)雜，所以即使在同一種族人群不同疾病背景的受試者中進(jìn)行KIR-HLA分型也可能存在一定

14、程度的差異。另外，本研究中AHE組的KIR 2DL3出現(xiàn)頻率顯著低于健康對(duì)照組，2DL3/HLA-C1的組合頻率低于健康對(duì)照組，盡管差異無顯著性，但仍具有一定的提示作用。既往已有研究11報(bào)道隨機(jī)人群KIR 2DL3陽性的NK細(xì)胞在抵御各種病毒感染的早期能夠分泌更多的干擾素，表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞脫顆粒作用，對(duì)感染的肝細(xì)胞具有直接的殺傷作用。KIR 3DL1/HLA-B是最早被發(fā)現(xiàn)的具有高度多變性的受體-配體基因型，雖然既往報(bào)道12提示二者出現(xiàn)在全球人群的頻率接近100%，但隨著人類的進(jìn)化，其演變出的基因亞型非常多。其中KIR 3DL1/HLA-Bw4不同亞型的特異性結(jié)合，不僅可表現(xiàn)出不同的受體-配體

15、結(jié)合親和性，而且在機(jī)體應(yīng)對(duì)感染功能方面存在差異。Boudreau等13的研究揭示了KIR 3DL1/HLA-Bw4基因表達(dá)的密度與結(jié)合力不同可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞抵抗HIV感染，證實(shí)其是HIV感染的保護(hù)性因素。本研究結(jié)果顯示，KIR 3DL1/HLA-Bw4在AHE組中的出現(xiàn)頻率較健康對(duì)照組低，提示若宿主為KIR 3DL1/HLA-Bw4基因型的表達(dá)者，AHE的患病幾率可有所減低。本研究中AHE組KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3的頻率顯著低于對(duì)照組，KIR 2DL5基因編碼的胞漿區(qū)域可通過聚集Src同源區(qū)域編碼的酪氨酸磷酸酶來抑制NK細(xì)胞的活性14，但其與機(jī)體病毒感染的具體效應(yīng)機(jī)制未見

16、明確報(bào)道。雖已有研究15報(bào)道3DL2/3DL3異常頻率在強(qiáng)直性脊髓炎的慢性炎癥中充當(dāng)一定的角色，但相關(guān)的病毒感染方面的報(bào)道并不多見，因此研究具有不同遺傳背景及不同臨床表型的HEV感染病例，可能會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，部分基因如2DL2/2DL4在本研究中的出現(xiàn)頻率有一定范圍的偏離，考慮到納入研究的隊(duì)列僅72例，可能是由于樣本量不足導(dǎo)致部分結(jié)果的偏差。一方面由于復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心是一家傳染病專科醫(yī)療機(jī)構(gòu)，該中心有3個(gè)肝病病區(qū)，未能將中心所有HEV感染者均納入研究；另一方面上海市是醫(yī)療衛(wèi)生相對(duì)發(fā)達(dá)的城市，人群受不潔飲食感染的機(jī)會(huì)較其他地區(qū)小。但總體來說，筆者對(duì)KIR-HLA進(jìn)行了比較

17、全面的分析，采取目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的PCR-SSP基因分型方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較為完整，排除了年齡及性別等混雜因素的干擾，得到相對(duì)客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示了散發(fā)性AHE與NK細(xì)胞KIR-HLA分型確實(shí)存在一定聯(lián)系。此外，本研究?jī)H在宿主免疫非常小的一方面進(jìn)行了研究分析，事實(shí)上KIR-HLA具有高度多態(tài)性，在不同地區(qū)、不同人種中的分布具有很大的差異，而且除KIR外，還有多種細(xì)胞表面抑制型、活化型受體及細(xì)胞因子參與噬肝病毒感染時(shí)NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。例如，在慢性乙型肝炎中，IL-10即發(fā)揮負(fù)性調(diào)控NK細(xì)胞功能的作用，影響NK細(xì)胞的抗病毒能力16。因此，進(jìn)一步多地區(qū)、大樣本及深層的免疫學(xué)研究了解NK細(xì)胞調(diào)節(jié)H

18、EV感染的機(jī)制是非常必要的，這也將會(huì)為HEV感染的預(yù)防和治療提供相應(yīng)的免疫學(xué)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 KAMAR N, BENDALL R, LEGRAND-ABRAVANEL F, et al. Hepatitis EJ. Lancet, 2012, 379(9835): 2477-2488.2 AGGARWAL R. Hepatitis E: epidemiology and natural historyJ. J Clin Exp Hepatol, 2013, 3(2): 125-133.3 ZHU FC, HUANG SJ, WU T, et al. Epidemiology of zoon

19、otic hepatitis E: a community-based surveillance study in a rural population in ChinaJ. PLoS One, 2014, 9(1): e87154.4 TRINCHIERI G. Biology of natural killer cellsJ. Adv Immunol, 1989, 47: 187-376.5 PARHAM P, NORMAN P J, ABI-RACHED L, et al. Human-specific evolution of killer cell immunoglobulin-li

20、ke receptor recognition of major histocompatibility complex class moleculesJ. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2012, 367(1590): 800-811.6 JAMIL KM, KHAKOO SI. KIR/HLA interactions and pathogen immunityJ. J Biomed Biotechnol, 2011, 2011: 298348.7 KULKARNI S, MARTIN MP, CARRINGTON M. KIR genotyping

21、 by multiplex PCR-SSPJ. Methods Mol Biol, 2010, 612: 365-375.8 PARHAM P, MOFFETT A. Variable NK cell receptors and their MHC class ligands in immunity, reproduction and human evolutionJ. Nat Rev Immunol, 2013, 13(2): 133-144.9 SIPS M, LIU Q, DRAGHI M, et al. HLA-C levels impact natural killer cell s

22、ubset distribution and functionJ. Hum Immunol, 2016, 77(12): 1147-1153.10 KHAKOO SI, THIO CL, MARTIN MP, et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infectionJ. Science, 2004, 305(5685): 872-874.11 AHLENSTIEL G, MARTIN M P, GAO X, et al. Distinct KIR/HLA compound

23、genotypes affect the kinetics of human antiviral natural killer cell responsesJ. J Clin Invest, 2008, 118(3): 1017-1026.12 OCONNOR GM, VIVIAN JP, WIDJAJA JM, et al. Mutational and structural analysis of KIR3DL1 reveals a lineage-defining allotypic dimorphism that impacts both HLA and peptide sensiti

24、vityJ. J Immunol, 2014, 192(6): 2875-2884.13 BOUDREAU JE, MULROONEY TJ, le LUDUEC JB, et al. KIR3DL1 and HLA-B Density and Binding Calibrate NK Education and Response to HIVJ. J Immunol, 2016, 196(8): 3398-3410.14 YUSA S, CATINA TL, CAMPBELL KS. KIR2DL5 can inhibit human NK cell activation via recru

25、itment of Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP-2)J. J Immunol, 2004, 172(12): 7385-7392.15 CAULI A, PIGA M, DESSOLE G, et al. Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) and HLA-class heavy chains in ankylosing spondylitisJ. Drug Dev Res, 2014,75(Suppl 1): s15-s19

26、.16 ZHOU L, LI XY, HUANG YH. Regulatory effect of interleukin-10 on natural killer cells in patients with chronic hepatitis BJ. J Clin Hepatol, 2016, 32(8): 1600-1603. (in Chinese) 周亮, 李小燕, 黃月華. 白細(xì)胞介素10對(duì)慢性乙型肝炎患者自然殺傷細(xì)胞的調(diào)控作用J. 臨床肝膽病雜志, 2016, 32(8): 1600-1603.引證本文：CHEN C, ZHANG SY, XUN JN, et al. Assoc

27、iation between killer cell immunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis EJ. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 462-465. (in Chinese)陳沖， 章樹業(yè)， 荀靜娜， 等. KIR-HLA基因多態(tài)性與散發(fā)性急性戊型肝炎的關(guān)系J. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(3): 462-465.(本文編輯：王 瑩)Association between killer cell i

28、mmunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis ECHEN Chong, ZHANG Shuye, XUN Jingna, et al.(Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China)Abstract：Objective To investig

29、ate the association between killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR)/human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E (AHE). Methods A total of 42 AHE patients who were hospitalized in First Department of Hepatitis, Public Health Clinical Center Affiliated to Fud

30、an University, from August 2015 to September 2016 were enrolled, and 30 healthy subjects were enrolled as control group. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood, and PCR/sequence specific primer was used for the amplification of KIR gene. Sanger sequencing was used to determine the genot

31、ype of HLA, and the association between KIR-HLA distribution and sporadic AHE was analyzed. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. Results A total of 16 KIR genes were detected in each group, including inhibitory receptor genes 2DL1-3, 2DL5, and 3DL1-3, activ

32、ating receptor genes 2DS1-5 and 3DS1, the special inhibitory/activating receptor gene 2DL4, internal reference gene DRB1, and pseudogene 2DP1, as well as HLA-B (including HLA-Bw4, HLA-Bw6, and HLA-Bw4/Bw6) and HLA-C (including HLA-C1/C1, HLA-C1/C2, and HLA-C2/C2), were also detected. Compared with the control grou