細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、花鱸肌肉和肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配 制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查 與調(diào)試。具體工作如下：一、清洗(1) 常用器具：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、廣口瓶、燒杯、 量筒、玻璃棒、電子天平、紗布、脫脂棉、止血鉗、鑷子、解剖 剪、解剖刀、解剖針、注射器、注射器過(guò)濾器、移液槍、槍頭、 離心管、細(xì)胞凍存管、酒精燈、試管架、超凈工作臺(tái)、倒置顯微 鏡、生化培養(yǎng)箱、烘箱、液氮罐、封口膜、噴壺、以及洗刷用品 等。(2) 玻璃器皿清洗：燒杯、量筒'玻璃棒' 廣口瓶(瓶蓋不泡鹽酸， 清

2、洗趕緊后直接高壓滅菌)等玻璃器皿自來(lái)水刷洗，除去灰塵， 烤箱中烘干，然后再浸入 5%稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、 砷等物。泡鹽酸12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗， 自來(lái)水沖干凈，然后用蒸餾水沖洗干凈后用烤箱烘干，高壓滅菌， 烘干備用。(3) 塑料器皿的清洗：細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶可以直接使用， 進(jìn)口槍頭、進(jìn)口離心管高壓滅菌。(4) 金屬制品的清洗：止血鉗、鑷子、解剖剪、解剖刀等先用洗滌劑 刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用 75%酒精擦拭，再用自來(lái)水， 然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好， 高壓滅菌，再烘干備用。(5) 棉織品：紗布和脫脂棉，高壓滅菌，再烘干

3、備用。二、溶液配制(1) PBS:配方一|-用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取 NaCl /8.0 g. KCl /0.2 g，KH2P04/ 0.29 g, Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于 800 mL 的超純水中，用玻璃 棒攪拌至溶解后調(diào)節(jié)pH值為7.27.4,然后定容至1L。置于高 壓滅菌鍋中滅菌30min，冷卻到室溫后分裝，于4°C冰箱冷藏備用。 配方二|-等滲0.01MPBS (1X PBS)細(xì)胞培養(yǎng)用，用電子天平準(zhǔn) 確稱(chēng)取NaCI/8.00g濃度為8/58.5=0.13675M,本配方主要靠NaCI, KCI/0.20a 濃度為 0.2/74.5=0.00268M, Na

4、gHPOg 12HD/2.90a 濃度 為 2.90/358= 0.0081M, NazHPO4 2HP/1.44g 濃度為 2.90/358= 0.0081M, KH2PO4/0.24g 濃度為 0.25/136= 0.0019M,溶于 800 mL 的dddH2O,用玻璃棒攪拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。置于 高壓滅菌鍋中滅菌30min,冷卻到室溫后分裝，于4C冰箱冷藏備 用。配方三|-用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取 NaCl /8.0 g, KCI /0.2 g , KH?P04/ 0.2g, Na2HPO4-7H?0/2.16 g, MgCL? 6HP/0.1g, CaCLg/0.1g

5、 溶于 800 mL的超純水中，用玻璃棒攪拌至溶解后調(diào)節(jié) pH值為7.2 7.4,然后定容至1L。置于高壓滅菌鍋中滅菌30min，冷卻到室溫 后分裝，于4C冰箱冷藏備用。(2) 0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末(1: 250) 0.25g,用PBS在 容量瓶中定容至100ml, 0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，于 20 C保存。(3) 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25g的Trypsin 和0.02g的EDTA ,用PBS在容量瓶中定容至100ml,調(diào)節(jié)pH值 為7.2-7.4,用孔徑為0.22卩砧勺濾膜過(guò)濾除菌，用2mL的離心管 分裝，凍存于-20C冰箱

6、備用。(4) 培 養(yǎng)基: 基礎(chǔ)培 養(yǎng)基 MEM ,這是使用最為廣泛的培養(yǎng)基；完全培 養(yǎng)基配置方法為：1L MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加4.76g HEPES充分溶 解后，用NaOH將PH調(diào)到7.4,加2ng/ml bFGF, 20%小牛血清， 1mmol/L的L-谷氨酸，50mmol/L的2-巰基乙醇，100IU/ml青霉 素和100ug/ml鏈霉素。(5) HEPES溶液：配置100X貯存液(1mol/L),在99ml培養(yǎng)液中加 入1ml貯存液，使最終濃度任為10mmol/L。00 X貯存液(1mol/L) 配置方法：取23.8gHEPES溶于90ml雙蒸水中，用1mol/L NaOH 調(diào)PH至7

7、.58.0,然后用水定容至100ml，過(guò)濾除菌，分裝2ml 小瓶，4C或-20C保存。三、培養(yǎng)室的滅菌( 1 ) 室內(nèi)滅菌： 每周打掃一次， 先用自來(lái)水拖地、 擦桌子、超凈工作 臺(tái)等，然后用新潔爾滅擦拭。(2) 生化培養(yǎng)箱滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用70%酒精擦 拭，再用紫外燈照射。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈， 定期消毒。 定期 更換蒸餾水。( 3) 實(shí)驗(yàn)前滅菌： 打開(kāi)紫外燈 20-30 分鐘 。( 4) 實(shí)驗(yàn)后滅菌： 用 70%酒精( 3% 新潔爾滅)擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、 倒置顯微鏡的載物臺(tái)，打開(kāi)紫外線(xiàn)照射 20-30min。四、實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：( 1 ) 肥皂洗手。( 2) 穿好隔離

8、衣、帶好隔離帽、口罩、穿好鞋套。(3) 戴乳膠手套， 75%酒精擦手。五、無(wú)菌操作(1) 凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培 養(yǎng)基、 胰蛋白酶的瓶子 均要用 70%酒精擦拭瓶子的外表面 。( 2) 靠近酒精燈火焰操作。( 3) 打開(kāi)和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。(4) 無(wú)菌級(jí)；別高的物品不能觸碰無(wú)菌級(jí)別低的物品。 手不能從敞開(kāi) 的瓶口上方經(jīng)過(guò)。( 5) 各種操作要靠近酒精燈， 動(dòng)作要輕、 準(zhǔn)確，不能亂碰。 如吸管不 能碰到廢液缸。(6) 吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。( 7) 手握試管、滴管、移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端。（8）盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精

9、擦拭臺(tái)面。（9）盡可能減少開(kāi)蓋時(shí)間。（10）隨時(shí)擦去任何溢出物。六、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法一：組織塊培養(yǎng)法（主要用于肌肉組織的培養(yǎng)）（1） 選取身體健康，無(wú)病的幼魚(yú)，用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚(yú)，70% 酒精消毒體表，然后放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待用。（2）解剖魚(yú)體，拿入無(wú)菌操作臺(tái)中，用無(wú)塵紙墊在魚(yú)體下，用直頭解 剖剪剔除皮膚，取體表肌肉組織,然后剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并 刮去多余的外膜，放入培養(yǎng)皿，用 PBS清洗三遍，放入70%酒 精中消毒34mim，再用PBS清洗3遍，除去血塊，用加入雙抗 的無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一遍。（3）切割組織塊，用解剖刀在培養(yǎng)皿上切割組織，切割過(guò)程中，加入 適量的培養(yǎng)液保持組織濕潤(rùn)。

10、（4）懸浮移瓶，切割完成后用新鮮的培養(yǎng)基懸浮小組織塊， 用移液槍 移入培養(yǎng)瓶中，吸棄上清液，保留少量培養(yǎng)液，蓋上瓶蓋，輕輕 晃動(dòng)瓶子，使組織塊在瓶底均勻鋪展開(kāi)，用玻璃棒調(diào)整組織塊使 其均勻分布，組織塊間隔0.5cm為宜,25cm2培養(yǎng)瓶中加入2030 個(gè)組織塊。（5）細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱中平放2小時(shí)，使組織貼壁，然后 側(cè)放半個(gè)小時(shí)，使液體浸出，然后吸出液體。（6）細(xì)胞培養(yǎng)，從培養(yǎng)瓶邊角加入 3ml培養(yǎng)基，蓋上瓶蓋，滿(mǎn)滿(mǎn)放 入培養(yǎng)箱中平放培養(yǎng)。如有懸浮，需重新貼壁。（7）初始培養(yǎng)5天后換一次培養(yǎng)基，后期每隔 2-4天換一次培養(yǎng)基。 換培養(yǎng)基的時(shí)候，吸走一半舊的培 養(yǎng)基, 再加入一半新的培

11、養(yǎng)基。（8）觀察、記錄細(xì)胞遷出情況，適時(shí)拍照。13天內(nèi)遷出較少，盡量 不要觀察。方法二 酶消化解離法（除肌肉和結(jié)締組織之外）(1) 選取身體健康，無(wú)病的幼魚(yú)，用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚(yú)，70% 酒精消毒體表，然后放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待用。(2) 解剖魚(yú)體，拿入無(wú)菌操作臺(tái)中，用無(wú)塵紙墊在魚(yú)體下，用解剖剪 打開(kāi)腹腔(注意不能碰破腸道)，剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并刮去 多余的外膜，放入培養(yǎng)皿，用 PBS清洗三遍，放入70%酒精中 消毒34mim，再用PBS清洗3遍，除去血塊，使肝臟呈灰白 色，用加入雙抗的無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一遍。(3) 胰酶消化，將組織切割成 1mm3大小，用1ml0.25%胰蛋白酶- 0.02% EDTA消化液消化20min后添加3ml完全培養(yǎng)基終止消 化，收集含有組織塊的細(xì)胞懸液，以 2200rpm離心2min;將所 得沉淀用1