綜合測定方法

1、實驗 1 植物體內硝態(tài)氮含量的測定植物體內硝態(tài)氮含量可以反映土壤氮素供應情況， 常作為施肥指標。 另外，蔬菜類作物特別是葉菜和根菜中常含有大量硝酸鹽，在烹調和腌制過程中可轉化為亞硝酸鹽而危害健康。因此，硝酸鹽含量又成為蔬菜及其加工品的重要品質指標。 測定植物體內的硝態(tài)氮含量，不僅能夠反映出植物的氮素營養(yǎng)狀況，而且對鑒定蔬菜及其加工品質也有重要的意義。傳統(tǒng)的硝酸鹽測定方法是采用適當?shù)倪€原劑先將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽， 再用對氨基苯磺酸與 - 萘胺法測定亞硝酸鹽含量。此法由于影響還原的條件不易掌握，難以得出穩(wěn)定的結果，而水楊酸法則十分穩(wěn)定可靠，是測定硝酸鹽含量的理想選擇。一、原理在濃酸條件下，NO3

2、 與水楊酸反應，生成硝基水楊酸。其反應式如下：OHOHH2SO4COOH + OHCOOH + NO 3NO 2生成的硝基水楊酸在堿性條件下（pH>12）呈黃色，最大吸收峰的波長為410nm，在一定范圍內，其顏色的深淺與含量成正比，可直接比色測定。二、儀器與用具分光光度計； 天平（感量 0.1mg）；20ml 刻度試管； 刻度吸量管0.1ml、0.5ml 、5ml 、10ml各 1 支； 50ml 容量瓶；小漏斗（5cm） 3 個；玻棒；洗耳球；電爐；鋁鍋；玻璃泡；7cm定量濾紙若干。三、試劑(1)500mg/L 硝態(tài)氮標準溶液： 精確稱取烘至恒重的 KNO 3 0.7221g 溶于蒸餾

3、水中， 定容至 200ml 。(2)5%水楊酸硫酸溶液：稱取5g 水楊酸溶于100ml 比重為 1.84 的濃硫酸中，攪拌溶解后，貯于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效。稱取 15g 水楊酸溶于300ml 比重為 1.84 的濃硫酸中，攪拌溶解后，貯于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效(3)8%氫氧化鈉溶液：80g 氫氧化鈉溶于1L 蒸餾水中即可。160g 氫氧化鈉溶于2L 蒸餾水中即可。四、方法1標準曲線的制作（ 1）吸取500mg/L硝態(tài)氮標準溶液1ml 、 2ml 、 3ml 、 4ml 、 6ml 、 8ml 、 10ml、 12ml分別放入50ml 容量瓶中，用無離子水定容至刻度，使之成10、2

4、0、30、 40、60、80、100、120mg/L 的系列標準溶液。（ 2）吸取上述系列標準溶液0.1ml ，分別放入刻度試管中，以0.1ml 蒸餾水代替標準溶液作空白。再分別加入0.4ml 5% 水楊酸硫酸溶液，搖勻，在室溫下放置20min 后，再加入 8% NaOH 溶液 9.5ml ，搖勻冷卻至室溫。顯色液總體積為10ml。1（ 3）繪制標準曲線： 以空白作參比，在 410 nm 波長下測定光密度。以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線并計算出回歸方程。2樣品中硝酸鹽的測定（ 1）樣品液的制備取一定量的植物材料剪碎混勻，用天平精確稱取材料2g 左右， 重復三次，分別放入三支

5、刻度試管中，各加入10ml 無離子水，用玻璃泡封口，置入沸水浴中提取 30min 。到時間后取出，用自來水冷卻，將提取液過濾到25ml 容量瓶中，并反復沖洗殘渣，最后定容至刻度。（ 2）樣品液的測定吸取樣品液0.1ml 分別于三支刻度試管中，然后加入5%水楊酸硫酸溶液0.4ml ，混勻后置室溫下20min ，再慢慢加入9.5ml 8%NaOH 溶液，待冷卻至室溫后，以空白作參比，在 410nm 波長下測其光密度。在標準曲線上查得或用回歸方程計算出硝態(tài)氮濃度，再用以下公式計算其含量。C VNO3N 含量 = W式中C標準曲線上查得或回歸方程計算得NO 3 N 濃度；V 提取樣品液總量；W 樣品鮮

6、重。實驗 2硝酸還原酶活性測定硝酸還原酶是植物氮素代謝中的關鍵酶之一，它與作物吸收利用氮肥有關，對作物的產量和品質有影響。因而可以把硝酸還原酶的活力當作植物營養(yǎng)或農田施肥的指標之一，也可作為品種選育的指標之一。通過本實驗可初步掌握測定硝酸還原酶活性的原理與方法。一、原理硝酸還原酶能將 NO3還原成 NO 2產生的 NO 2 的量與硝酸還原酶的活性相關。通過測定反應液中產生的NO2含量，即可確定酶活性大小。NO 2 含量可用磺胺顯色法測定。 NO2與磺胺及 a萘胺在酸性條件下生成紅色偶氮化合物 其反應如下：酶活性可用單位鮮重組織在單位時間內產生的亞硝酸量來表示：亞硝酸態(tài)氮微克數(shù)/克鮮重組織1 小

7、時。二、實驗材料、儀器和試劑1實驗材料植物的根、莖、葉，本實驗選用白蘿卜葉片2儀器（ 1）分光光度計（ 2）離心機（ 3）真空泵和真空干燥器（ 4）恒溫水浴鍋（ 5）恒溫箱（ 6）刻度吸管（ lml 、 2ml、 5ml ）（ 7）試管（ 8）天平（9）三角瓶（ 50ml）3試劑（ 1） 亞硝酸鈉標準液：稱取 0.1000g 亞硝酸鈉（ AR），用蒸餾水溶解并定容至 100ml。然后吸取 5ml 再用蒸餾水定客至 1000m1。即為濃度 5g ml 的亞硝酸鈉標準液。(2)0.1mol/lpH7.5磷酸沖液230.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4&#

8、183;2H2O，加蒸餾水（或者去離子水）定容到 1000ml （總共 1500ML(先配 1000Ml 再配 500ml,(15.0453g Na2HPO4· 12H2O,1.2483 NaH2PO4·2H2O，加蒸餾水（或者去離子水）定容到500ml) 。（ 3） 3mol/L HCl：125ml 濃鹽酸加蒸餾水定容到 500ml 。 375Ml 濃鹽酸加蒸餾水定容到 1500ml（ 4） 1磺胺溶液： 5.0g 磺胺溶于500ml3mol/LHCl 中?？偣?1500ml (1000ml+500ml)15.0 磺胺溶于1500ml 3mol/LHCl 中（ 5） 0.

9、2 a- 萘胺溶液： 1.0ga- 萘胺溶于125ml 冰醋酸后用蒸餾水定容到500ml，貯于棕色瓶中。0.2 a- 萘胺溶液：2.0g a-萘胺溶于250ml 冰醋酸后用蒸餾水定容到1000ml, 貯于棕色瓶中 。（ 6） 30%三氯乙酸溶液：30g 三氯乙酸。水溶后定容至100ml。150g 三氯乙酸 .水溶后定容至500ml.（ 7）KNO3溶于 1000ml 蒸餾水中 +11.11 gKNO3溶于 500ml 蒸餾水中 .四、操作步驟1標準曲線的制作取 6 支試管，編號，按下表操作管號操作項目123456NaNO 2 淀標準液 (ml)00.40.81.21.62.0蒸餾水 (ml)2

10、.01.61.20.80.40NaNO2 含量（ g）0246810磺胺 (ml)各 4 萘胺各 4搖勻在 30水浴中保溫20 分鐘。然后在520ml 波長下比色測定消光值。以亞硝酸鈉含量為橫坐標，消光值為縱坐標繪制標準曲線。2酶反應和酶活性測定0.5cm2h 的小片，混勻后稱三份，每份將白蘿卜葉片洗靜，剪成0.5 1.0g，分另放人50ml 的三角瓶中，編號按下表加試劑搖勻，置真空于燥器中，抽氣10 分鐘。然后將三角瓶放人恒溫箱，在30暗條件下保溫 30 分鐘。取出后向 2，3 號瓶中分別加人 l ml 30 三氯乙酸終止反應，將反應液離心（ 3000rmp 10 分鐘）或過濾。分另吸取 2

11、ml 反應液于三只試管中各加 4ml 1磺胺和 0.2a萘胺。3搖勻在 30水浴中保溫20 分鐘。然后在520ml 波長下比色測定消光值。五、結果與計算酶活性（亞硝酸鈉g g 鮮重· h）亞硝酸鈉微克數(shù)（ g）×稀釋倍數(shù)樣品重（ g）×時間（ h）六、注意事項1酶促反應在暗條件下進行，以防光照下葉綠體形成還原型鐵氧還蛋白，促使亞硝酸還原酶把NO2 還原成 NH 3。2田間采樣應在早晨9 點以后，光合作用進行了一段時間再進行。實驗三植物體內 GS 谷氨酰胺合成酶活力的測定方法一一、原理2+谷氨酰胺合成酶（ GS）是植物體內氨同化的關鍵酶之一，在ATP和 Mg 存在下

12、，它催化植物體內谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應體系中，谷氨酰胺轉化為谷氨酰基異羥肟酸，進而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物，該絡合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。谷氨酰胺合成酶活性可用產生的 谷氨酰基異羥肟酸與鐵絡合物的生成量來表示，單位 1 1 mol · mg protein · h。也可間接用 540nm處吸1 1光值的大小來表示，單位 A· mgprotein · h。二、 儀器與用具冷凍離心機；分光光度計；天平；研缽；恒溫水??；剪刀；移液管（2ml 、 1ml ）。三、試劑先配制 0.05Mol/l的鹽酸溶液：加入4.15ml濃鹽

13、酸，定溶到 1000ml, 再配制 0.1mol/l的鹽酸溶液： 8.3ml 濃鹽酸，定溶到1000ml.提取緩沖液：2+（ 1）0.05mol/LTris-HCl ， pH8.0，內含蔗糖。2mmol/L Mg ， 2mmol/L DTT ， 0.4mol/L稱取 Tris （三羥甲基氨基甲烷）1.5295g ， 0.1245g MgSO4· 7H2O，0.1543g DTT （二硫蘇糖醇）和 34.25g 蔗糖，去離子水溶解后，用0.05mol/L HCl 調至 pH8.0 ，最后定容至250ml；重新配制 500ml：0.05mol/L Tris-HCl2+，pH8.0 ，內含

14、 2mmol/L Mg ，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。稱取 Tris:3.0590g,，0.2490MgSO4.7H2O，0.3086gDTT( 二硫蘇糖醇 ) 和 68.50g蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HCl調至 pH8.0 ，最后定容至 500ml。注意： 0.05mol/l HCl的用量。 pH用什么 ,pH 試紙。（ 2）反應混合液A（ 0.1mol/L Tris-HCl緩沖， pH7.4 ）：2+谷氨酸鈉鹽， 20mmol/L 半胱氨酸和 2mmol/L EGTA，稱取內含 80mmol/L Mg ，20mmol/L3.0590g Tris ，4

15、.9795gMgSO·7H O, 0.8628g 谷氨酸鈉鹽， 0.6057g 半胱氨酸， 0.1920gEGTA，42去離子水溶解后，用0.1mol/L HCl調至 pH7.4 ，定容至 250ml；（ 3）反應混合液B（含鹽酸羥胺， pH7.4 ）：反應混合液 A 的成分再加入 80mol/L鹽酸羥胺， pH7.4；（加入鹽酸羥胺1389.8g., 鹽酸羥胺有巨毒）（ 4）顯色劑（ 0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3 和 0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA （三氯乙酸）， 10.1021g FeCl· 6H O，去離子水溶解

16、后，加5ml 濃鹽酸，32定容至 100ml；6.6352 三氯乙酸，去離子水溶解后，加10Ml 濃鹽酸，定容至 200ml.（ 5） 40mmol/L ATP 溶液： 0.1210g ATP 溶于 5ml 去離子水中（臨用前配制） 。 40mmol/LATP 溶液： 2.4200ATP 溶于 100ml 去離子水中（臨用前配制）四、方法41.粗酶液提取稱取植物材料1g 于研缽中，加3ml 提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉移于離心管中，4下 15,000g 離心 20min ，上清液即為粗酶液。2.反應1.6ml 反應混合液B ，加入 0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混勻，于37

17、下保溫半小時，加入顯色劑1ml ，搖勻并放置片刻后，于5,000g 下離心 10min ，取上清液測定540nm 處的吸光值，以加入1.6ml 反應混合液A 的為對照。3.粗酶液中可溶性蛋白質測定取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取 2ml 用考馬斯亮藍 G-250 測定可溶性蛋白質（見實驗28）。4.原始數(shù)據(jù)記載5.結果計算：AGS 活力 (A · mg1protein · h1) PVt式中A 540nm 處的吸光值；P粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）；V 反應體系中加入的粗酶液體積（ml ）；T 反應時間（ h）。方法二：一、原理ATP 和 Mg 2

18、+存在下，它催谷氨酰胺合成酶（ GS）是植物體內氨同化的關鍵酶之一，在化植物體內谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應體系中，谷氨酰胺轉化為谷氨?；惲u肟酸，進而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物，該絡合物在540nm 處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。 谷氨酰胺合成酶活性可用產生的谷氨?；惲u肟酸與鐵絡合物的生成量來表示，單位 mol ·mg1 1處吸光值的大小來表示，單位 A ·mgprotein ·h 。也可間接用 540nm 1 1。protein ·h二、儀器：冷凍離心機；分光光度計；天平；研缽；恒溫水?。患舻?；移液管（2ml 、 1m三、藥品：提取液：

19、0.1mol/lTris-HCL,pH7.6,1.0mmol/LEDTA,1.0mmol/LMgCl 2.2O,6H10mmol/L2- 硫基乙醇：加 6.1180gTris, pH7.6,0.1920gEDTA,0.1245MgSO4.7H2O,0.3907g2-硫基乙醇 ,去離子水溶解后，用 0.05 mol/L HCl 調至pH7.6，最后定容至 500ml.四、方法1.粗酶液提取6 谷氨酸合酶活力測定改良茚三酮法定量的谷氨酸合酶活力測定技術基本原理不同氨基酸在同一pH 下所帶的凈電荷的種類和數(shù)量不同。一pH6-7 范圍內 ,谷氨酞胺所帶的凈電荷為零,而谷氨酸帶負電荷(pH7.0 時最大

20、為 -1.00). 當含反應底物谷氨酞胺和產物谷氨酸的酶反應液在中性條件下通過醋酸型陰離子交換樹脂柱時,谷氨酞胺不帶電荷,不能被樹脂吸附 ,用蒸餾水即可將它從柱子上洗脫下來,而谷氨酸帶負電荷與樹脂上吸附的醋酸根離子相互置換而被吸附在柱子上,當用高濃度的醋酸洗脫時它又被醋酸根離子置換下來。這樣就將產物谷氨酸與反應物谷氨酞胺分離開來。再用改良茚三酮法測定谷氨酸量后,就可得到以產生的谷氨酸量表示的谷氨酸合酶.儀器：離子交換樹脂提取緩沖液林振武11的方法，酶提取液 : 100 mmol L 1 磷酸鈉緩沖液( pH 7. 5 ) ，內含100 mmol5L 1KCl5 mmol L 1EDTA0. 1

21、% ( v /v) 巰基乙醇 0.1% ( v /v )曲拉通X 100 ， 0. 5 mmol L 1PMSF (苯甲基磺酰氟，現(xiàn)用現(xiàn)加) 。酶反應液 (1)50mmol L 1L 谷氨酰胺 (2)50 mmol L 1酮戊二酸（ 3） 0. 25 mmolL 1NADH (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸) 、（ 4）20 mmol L 1Na2 S2 O4 (溶于 20 mmol L 1NaHCO3 )。各試劑均用 50 mmol L 1 磷酸鈉緩沖液 ( pH 7. 5) 配制 。茚三酮試劑，總體積： 110ml,0.55g 茚三酮， 1.24g CdCl2.2H2O,80ml 90% 乙醇， 1

22、00ml 冰醋酸， 20ml蒸餾水。這樣配制的茚三酮試劑在空氣中穩(wěn)定 ,在冰箱中可以保存一個月。酶的提?。悍Q取植物材料1g 于研缽中，加 3ml 提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉移于離心管中， 4下 15,000g離心 20min ，上清液即為粗酶液，(根據(jù)谷氨酰胺合成酶 )酶活力測定：操作步驟反應液各?。?）（ 2）（ 3）各取置 30水浴預保溫分鐘 , 再加 0.2ml 粗酶液 ,最后加 0.2ml預保溫過的反應液(4) 起始反應 , 反應混合液總體積1 毫升 , 以不加鐵氧還蛋白加( 0.2ml50mmol/l 磷酸緩沖液代替 )為對照 . 混合液于30保溫 10 分鐘后，于沸水浴加熱1.5 分鐘 ,再劇烈搖動幾分鐘以終止反應,待待冷后用0.5mol/lHCl將 pH調至 7.0然后4000rmp 離心10分鐘,上清液及2ml 洗離心管的水全部上離子交換柱, 等樣品全部進入柱后用 5ml 水 ,0.5ml 醋酸依次洗柱子,洗脫液丟棄， 最后用醋酸洗脫吸附在柱子上的谷氨酸 ,收集全部洗脫液 . 直接加 3ml茚三酮試劑，混勻后于 80水浴保溫分鐘后立即取出，用冰水迅速冷卻,測 506nm 處的消光系數(shù) ,對照工作曲線求出產生的谷氨酸的量.工作曲線