體外PD-L1通路封閉實(shí)驗(yàn)步驟

1、體外體外PD-1/PD-L1PD-1/PD-L1通路封閉實(shí)驗(yàn)步驟通路封閉實(shí)驗(yàn)步驟1）每個(gè)樣本留取5x106個(gè)PBMC，在T25的培養(yǎng)瓶中懸浮于3ml的完全培養(yǎng)基中；2）每個(gè)培養(yǎng)瓶加入10g Purified anti-PD-L1;3）在37、5%CO2孵箱中孵育6天；4）6天后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無菌的流式管中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，計(jì)活細(xì)胞的數(shù)目；5）用R10調(diào)整細(xì)胞濃度至1x107/ml;6）ICS檢測(cè)阻斷后細(xì)胞免疫功能特征。封閉階段封閉階段1 ）在無菌的96孔板中，建立 ICS 實(shí)驗(yàn)（每份標(biāo)本 3 孔），每孔包括包括以下試劑： PBMC: 1 x 107/ml in R10,100

2、l1l CD28-Pure (BD Pharmingen) 1l CD49d-Pure (BD Pharmingen) Monensin ( Golgistop , 0.7ul/ml ; BD Biosciences ) FITC-CD 107a (10 l/test;BD Biosciences) 同時(shí)建立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，以及實(shí)驗(yàn)組（HIV-1肽庫(kù)）陰性對(duì)照：無刺激原陽(yáng)性對(duì)照：Staphylococcus enterotoxin B ( SEB,1g/ml,sigma-Aldrich) HIV-1肽庫(kù)：Gag Nef Env Pol VVVRT 各2 l 刺激階段刺激階段2 ）在 37C

3、、5% CO2 孵箱中孵育1小時(shí)；3 ）每孔細(xì)胞中加入 10 l brefeldinA ( 10 g/ml;sigma-Aldrich)，繼續(xù)在 37、5% CO2孵箱中孵育 5 小時(shí)； 4 ）取出細(xì)胞，放入 4 C 冰箱中過夜或直接繼續(xù)下列步驟。下列所有步驟均要求避光，因此孵育過程必須使用錫箔紙覆蓋細(xì)胞。 1 ）將 96 孔板中的刺激后的 PBMC 轉(zhuǎn)移到流式管中； 2 ）在細(xì)胞管中加入 PBS，約 2/3 管，離心 1500 rpm x 10 分鐘； 3 ）將上清倒到廢液缸，用紗布或吸水紙除去殘留液； 4 ）加入表面抗體：Anti-CD3-ECD ( 5 l) Anti-CD4-A PC-

4、Cy7 (2.5 l)Anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (10 l) Anti-PD-1-APC (10 l)染色分析階段染色分析階段5）以錫箔紙覆蓋細(xì)胞后，在4 冰箱中孵育30分鐘。 6）用PBS洗滌后，加入250 l Fixation/perm ( BD Biosciences ) ，充分混勻后在4冰箱中孵育20分鐘；7) 1 x Perm/Washbuffe（BD Bioscienccs ）洗滌兩次，每次加入 2 ml 的洗液。離心 1500 rpm x 10 分鐘； 8）加入抗細(xì)胞因子抗體：anti-IFN-PE-Cy7 mAb (10l Biolegend）；9）以錫箔紙覆蓋細(xì)胞后，在生物安全柜中室溫孵育 20 分鐘 ；10）用 PBS 洗滌一遍，離心1500 rpm x 10分鐘（室溫）；11）以 300 l 2多聚甲醛