堿性磷酸酶比活力測定

1、實驗實驗 堿性磷酸酶比活力測定堿性磷酸酶比活力測定實驗?zāi)康恼莆彰富钚詼y定方法的一般原理方法測定堿性磷酸酶制備各步驟酶制劑比活力實驗原理酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反應(yīng)的能力。可以用在一定條件下所催化的某一特定化學(xué)速度表示。 酶催化反應(yīng)速度越快，酶活性越高，反之則愈低。 底物減少量或生成物增加量酶促反應(yīng)速度v = 單位時間 產(chǎn)物濃度 v=a/b 酶促反應(yīng)進程曲線 反應(yīng)時間要真實反映出酶活力的大小，就應(yīng)該在產(chǎn)物生成量與酶反應(yīng)時間成正比的這一段時間內(nèi)進行初速度的測定?；盍y定中應(yīng)注意的幾個問題(1) 活力測定一般測定產(chǎn)物增加速度為好。(2) 測活過程應(yīng)注意外界環(huán)境的影響。ab方法：1.終止

2、測定法（終點法）終止測定法是在酶和底物反應(yīng)達到預(yù)定的時間時，立即加入終止劑使酶變性，終止酶促反應(yīng)，在這段反應(yīng)時間里面，產(chǎn)物的生成量基本成線性線性增加，用這段反應(yīng)時間內(nèi)的平均速率平均速率代替反應(yīng)初速率。2.動力學(xué)分析法（連續(xù)監(jiān)測法或速率法）堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase ，簡稱為ALPase)廣泛存在于微生物界和動物界。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。對對-硝基苯磷酸二鈉法硝基苯磷酸二鈉法堿性磷酸酶催化對硝基苯磷酸鈉鹽(pNPP)水解反應(yīng)，以對-硝

3、基苯磷酸二鈉（pNPP）為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液（含2 mmol/L Mg2+）的測活體系中檢測酶催化pNPP水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯酚（pNP）的量。產(chǎn)物pNP在405 nm處有最大的吸收峰，可以根據(jù)OD405 nm 值的增加計算酶活力的大小。反應(yīng)式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 無色 黃色 可通過分光光度法測定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。 堿性磷酸酶堿性磷酸酶酶活力單位定義為：在37下，以0.5 mmol/L pNPP為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L Mg2+的測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mol pNP的酶量定為1個酶活力單位。酶的比活力定義

4、為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。磷酸苯二鈉法在pH10 環(huán)境中，ALPase催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，苯酚與4-氨基安替比林反應(yīng)生成色素原，該色素原經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞衍生物。測定紅色物質(zhì)的吸光度就可以計算酶活性的大小。反應(yīng)式如下：磷酸苯二鈉+H2O 苯酚+磷酸氫二鈉 苯酚+4-氨基安替比林 紅色醌亞胺衍生物堿性磷酸酶堿性磷酸酶操作方法1 對硝基苯酚標準曲線的制作對硝基苯酚標準曲線的制作（不做）（不做）：取15支試管編號，0號一支，17號各二支，按下列表格操作。管 號01234567 pNP含量 (mol)00.050.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.3

5、5 0.5mol/mL pNP (mL)00.10.20.30.40.50.60.7 H2O (mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1 Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mL OD 405 nm以對硝基苯酚的絕對量(mol數(shù))為橫坐標，OD405nm值為縱坐標，繪制標準曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)()值。8.80103( mol/L)-1cm-1管 號空白1235 mM pNPP(mL)各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL)

6、各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入0.2 mL H2O (mL)各0.50mL混勻，37，5分鐘 酶液（mL）/各0.1mL37，精確反應(yīng)10分鐘 0.2 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mL 酶液（mL）0.1mL OD 405 nm2 酶活力的測定酶活力的測定以0號管調(diào)零點，測定各管的OD405nm值，從對照標準曲線求出產(chǎn)物的mol數(shù)，算出酶活力。3 蛋白濃度的測定蛋白濃度的測定本實驗采用雙縮脲法測定蛋白濃度。分離提取的三步酶制劑按一定比例用Tris-HCl緩沖液稀釋，稀釋倍數(shù)視溶液的蛋白濃度高低而定。（一般稀釋5-10倍）。4 結(jié)果處理結(jié)

7、果處理AVC= (mg/mL)VtB=(U/mL) 21蛋白濃度酶活力計算：式中：A為稀釋倍數(shù)，B為由標準曲線查得的pNP mol數(shù)或者通過 8.80103( mol/L)-1cm-1換算（B=4000OD405/ )，t為反應(yīng)時間，C為由標準曲線查得的蛋白mg數(shù)，V1為測定酶活力所用的酶量(mL數(shù)) V2為測定蛋白濃度所用的酶量(mL數(shù))酶的比活力（U/mg） 酶活力（U/mL） 蛋白濃度（mg/mL）純化倍數(shù)=各步比活力/第一步比活力得率%=各步總活力*100/第一步總活力 將測定的數(shù)據(jù)或計算結(jié)果用下表記錄。（此為例子）將測定的數(shù)據(jù)或計算結(jié)果用下表記錄。（此為例子） 步驟總體積 mL蛋白m

8、g/mL總蛋白mg酶活力U/mL總活力U比活力U/mg純化倍數(shù)得率%勻漿過濾液4007.24 20.3 正丁醇處理上清液470 33.8 0.35飽和(NH4)2SO4上清液440 35.3 0.7飽和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3 314.7 DEAE-32酶液9.63.82 1002.2 Sephadex G75酶液13.20.49 451.5 Sephadex G200酶液6.80.21 509.3 注意事項 取液量一定要準確。反應(yīng)時間一定要精確。加酶前后一定要將試劑混勻?？瞻讓φ找欢ㄒ燃覰aOH，后加酶。移液管或微量移液器的使用比色杯的使用三步樣品一定要完全化凍才能進行

9、測定水浴管號1122 33 44 55 加酶時間（min）0.5m1m1.5m 2m2.5m 3m3.5m 4m4.5m 5m加NaOH時間10.5 1111.51212.51313.51414.515反應(yīng)時間（min）10101010101010101010微量移液器的使用微量移液器的使用吸液：吸液：調(diào)好量程后，用大拇指將按鈕按下至第一停點，然后將移液器的吸嘴垂直插入液面幾毫米，慢慢松開按鈕慢慢松開按鈕回原點，吸取所需液體。排液：排液：吸嘴貼著容器壁，接著將按鈕按至第一停點，排出液體排出殘液：排出殘液：稍停片刻待剩余液體聚集后，繼續(xù)按按鈕至第二停點，吹出殘余的液體。最后松開按鈕。設(shè)定量程時，切忌使移液器量程旋鈕超出其標示的最小和最大量程。選用合適量程的移液器，不能用大量程的移液器移取小體積樣品。 在將槍頭套上移液器時，切忌使勁地用槍砸槍頭盒。 正確的方法是將移液槍（器）垂直插入槍頭中，稍微稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動