真菌熒光原位雜交技術(shù)-w

1、真菌熒光原位雜交技術(shù)-吳松松第一步：熒光探針標(biāo)記。1， 利用已知的特異序列送公司合成探針。各種情況的探針均適合，<500bp的片段最好用此種方法。2， 切口平移法。用DNA polymerase I和DNase I。適合較大的片段，一般>7kb，1kb的片段效果較差。1×DNA polymerase buffer（1×） 5 ldNTP（10M） 5 lBio-11-dUTP or Dig-11-dUTP（1mM） 1.2 lDNase (0.005U/l) 1lDNA polymerase (coli.10U/) 1.2lDNA（2.5g） XlddH2O 3

2、6.6-XlTotal 50l混勻后置于原位PCR或者于水浴鍋中154h，然后利用1的瓊脂糖凝膠檢測(cè)片段大小，在100500bp左右表示酶切完全，此時(shí)可停止反應(yīng)。另有FISH Tag DNA Multicolor Kit中也是切口平移法，但探針標(biāo)記時(shí)需結(jié)合熒光染料，步驟比較復(fù)雜。3， 隨機(jī)引物法。用隨機(jī)引物合成探針，此種方法適合cDNA片段為5001000bp的片段。500ngDNA X l2.5X Random Primers Solution: 20 l10X dNTP Mixture: 5 lddH2O 24-XlKlenow Fragment 1 l1.冰上操作：cDNA大約500 n

3、g DNA（5-20 l）的離心管中加入20 l 2.5X Random PrimersSolution.于沸水中變性5min，立即放于冰上2. 將融化的10X dNTP Mixture及ddH2O提前放于冰上并依次加入，輕輕混勻。3. 加入 1 l Klenow Fragmen輕輕混勻（劇烈震蕩酶易失活），并低速離心30sce。4.37孵育60min后加入5 l Stop Buffer。5.無水乙醇或異丙醇沉淀（加核酸助沉劑），75%乙醇清洗沉淀并用50l DEPC-H2O溶解。 6.電泳檢測(cè)探針質(zhì)量。片段集中在250500bp質(zhì)量較好，可用于原位雜交。第二步：樣品的處理。1， PDB搖培3

4、5d的菌絲或者收集的真菌孢子分別用DEPC-H2O和1×PBS清洗一次，8000rpm離心。2， CSK Buffer處理。加入CSK Buffer（0.5%TritonX-100,，10 mM VRC或RRI）于4處理1012min。第三步：樣品的酶解與固定。1， 用4%的多聚甲醛浸泡，于4暗處理1-4h。2， 挑取菌絲或吸取孢子均勻涂與PE玻片上，風(fēng)干使樣品固定于玻片上。3， 用DEPC-treated水洗兩次，風(fēng)干。用1×PBS滲透緩沖液覆蓋（1%SDS，1% 裂解酶,0.1% 蝸牛酶），30°C ，10min （實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)如果30min，菌絲降解的比較嚴(yán)重

5、，因此可能應(yīng)該減少酶解時(shí)間,15min），用DEPC處理的水沖洗，晾干。然后用50%，80%和100%的乙醇進(jìn)行脫水處理，每次5min。（參考文獻(xiàn)：Alpine Stream by New Taxon-Specific In Situ Detection of Freshwater Fungi） .第四步：雜交1， 雜交液準(zhǔn)備。2×hybridization buffer：4×SSC，40%硫酸葡聚糖，2mg/ml BSA，50%甲酰胺。將探針于9598變性5min后立即冰浴3min，以探針終濃度為0.565ng/l的濃度加入冰上預(yù)冷的雜交緩沖液中。探針濃度可以降低到2.5

6、ng/ul（經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，該濃度的探針還是高，不過沒有檢測(cè)探針的質(zhì)量，可以先檢測(cè)探針的質(zhì)量，200-500bp）。2， 50l體積 1片 2片 4片 8片100%去離子甲酰胺 25 l 50l 100l 200l20×SSC 5 l 10l 20l 40l5%BSA(SS) 0.5l 1 l 2 l 4l10×SDS 2.5 l 5 l 10l 20l50%硫酸葡聚糖 10 l 20l 40l 80l混勻，離心，然后加入3， Bio-11-dUTP標(biāo)記的探針 50-100ng/片 10l 20l4， Dig-11-dUTP標(biāo)記的探針 50-100ng/片 10l 20l5，6，

7、 雜交。每玻片100150l雜交液滴加于樣品上，蓋膜與46暗盒（底部加入浸有2×SSC的吸水紙）中孵育過夜（1620h）。第五步：雜交后洗脫。1， 用2×SSC配制50的甲酰胺溶液，42水浴預(yù)熱，同時(shí)預(yù)熱兩份2×SSC溶液，預(yù)熱20min以上。2， 把玻片從濕盒中拿出，于2×SSC揭膜。3， 于預(yù)熱的甲酰胺中，42搖床搖10min，轉(zhuǎn)入預(yù)熱的2×SSC中搖兩次，每次5 min。第六步：標(biāo)抗及結(jié)合鏈霉親和素。1， 地高辛標(biāo)抗。室溫的2×SSC搖一次，5 min。4×SSC/Tween 20(0.2%)搖一次，5 min，（配制

8、：1L 4×SSC加Tween 2ml）。每片加新鮮的5BSA（4片配制：0.1gBSA + 2ml1×PBS）100l蓋膜，室溫放置5 min，直接用鑷子揭去蓋膜。（以后每步避光）配制anti-dig FITC溶液（用5BSA稀釋75倍），每片加100l，蓋膜后濕盒中37溫育1h。4×SSC/Tween 20(0.2%)搖洗3次，每次5min，1×PBS緩沖液中洗1次5 min。2， 生物素結(jié)合鏈霉親和素。1×PBS漂洗一次，5min。5的BSA100l每片，蓋膜，室溫放置5min, 揭膜。用1：40配置Cy3耦聯(lián)的鏈親和素。每片50l，蓋膜

9、，濕盒37度溫育30 min1×PBS洗三次，每次5 min第七步：DAPI負(fù)染與熒光信號(hào)檢測(cè)1，5g/ml的DAPI每片100l。7， 蓋膜室溫放置15 min，1×PBS揭膜。8， 每片加抗熒光猝滅劑一滴（10l槍）。3， 用干凈的蓋片蓋好，于熒光顯微鏡下檢測(cè)。4避光保存，完想保留玻片時(shí)：2×SSC 搖10min,70%乙醇搖3min，100%乙醇搖3min,空氣干燥。所需試劑準(zhǔn)備20×SSC：0.3M sodium citrate, 3M NaCl(pH 7.0)CSK Buffer：100 mMNaCl, 300 mM sucrose，3 mM

10、MgCl2，10 mM PIPES (pH 6.8)Store at 4°C.1×PBS：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 10mM， KH2PO4 2mM（pH7.27.4）4%多聚甲醛：2g多聚甲醛加入30ml1×PBS中，60加熱10min后加入少量0.1M NaOH搖勻至多聚甲醛完全溶解后1×PBS定容至50ml。10ml:0.4g多聚甲醛 加7ml水，加40ul 5M NaOH，在定容至10ml注意事項(xiàng)1、做RNA FISH實(shí)驗(yàn)，首先要防止RNA酶的污染。操作過程中應(yīng)自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經(jīng)常更換。所有實(shí)驗(yàn)

11、用到玻璃制品都要高溫滅菌，且各種溶液要用DEPC水配制。 2、去污劑triton X-100處理的目的是增加細(xì)胞的通透性，利于雜交探針進(jìn)入細(xì)胞，其處理時(shí)間因應(yīng)不同的細(xì)胞而有所不同。注意：過度的去污劑處可能會(huì)引起靶核酸的丟失。 3、熒光見光就會(huì)淬滅，因此操作過程要做好避光。4、實(shí)驗(yàn)所用探針是雙鏈DNA探針，而雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。因此在做RNA FISH雜交前，探針必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。5、探針的濃度因其種類和實(shí)驗(yàn)要求而有所不同，一般為0.5-5ng/ul。合適的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。6、雜交反應(yīng)時(shí)，蓋玻片不可有氣泡，不然妨礙探針與細(xì)胞的接觸。7、玻片經(jīng)antifade reagent封片后可在4暗處保存2-3星期而不失去全部熒光，但FISH操作完成后要及時(shí)觀察采圖，地高辛標(biāo)記的隔夜觀察效果較好。 8