質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)分析分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)v1 1、掌握限制性內(nèi)切酶的工作原理，掌握酶、掌握限制性內(nèi)切酶的工作原理，掌握酶切體系建立原則切體系建立原則v2 2、熟悉基因工程所用的限制酶的特點(diǎn)、熟悉基因工程所用的限制酶的特點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理能特異地結(jié)合于一段被稱能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。u 。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切酶酶酶分子酶分子識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) 限制作用

2、是限制作用是否需用否需用 ATP類類 三亞基雙功三亞基雙功能酶能酶 二分非對(duì)稱二分非對(duì)稱至少在識(shí)別至少在識(shí)別位點(diǎn)外位點(diǎn)外 1000 bpYes類類(93%)內(nèi)切酶與甲內(nèi)切酶與甲基化酶分子基化酶分子不在一起不在一起4-6 bp, 大多大多數(shù)為回文對(duì)數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)稱結(jié)構(gòu) 在識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)無特別位點(diǎn)無特異性異性No類類二亞基雙功二亞基雙功能酶能酶 5-7 bp 非對(duì)非對(duì)稱稱在識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下 游下 游 2 4 -26bpYes分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)v類類限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶v分子克隆中常用的為分子克隆中常用的為II類限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)類限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)

3、長度為長度為4、5或或6個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列。限個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列。限制酶的切割點(diǎn)因酶而異，有些產(chǎn)生帶平端的制酶的切割點(diǎn)因酶而異，有些產(chǎn)生帶平端的DNA片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘性末端的片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘性末端的DNA。如。如EcoR切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端補(bǔ)的粘性末端： 5GAATTC3 5 G AATTC3 v 3CTTAA G 5 3 CTTAA G5分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器與試劑v儀器：儀器：恒溫水浴鍋、離心管、移液器、槍頭、離恒溫水浴鍋、離心管、移液器、槍頭

4、、離心機(jī)、電泳設(shè)備等。心機(jī)、電泳設(shè)備等。v試劑：試劑： pUC19質(zhì)粒，質(zhì)粒，EcoR I酶，酶切緩沖液，瓊酶，酶切緩沖液，瓊脂糖，電泳緩沖液，脂糖，電泳緩沖液，EB，10 x上樣緩沖液，上樣緩沖液，無菌水等。無菌水等。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)v1、在一個(gè)潔凈的、在一個(gè)潔凈的0.5 ml離心管中混勻下列反應(yīng)物離心管中混勻下列反應(yīng)物反應(yīng)物反應(yīng)物體積（體積（l）dd H2O510Buffer1.5質(zhì)粒質(zhì)粒DNA (1g)8EcoR I (10U)0.5最終至最終至15 l6000 rpm/min稍離稍離15 s，將反應(yīng)物置于，將反應(yīng)物置于37水浴中溫浴水浴中溫浴12 hr。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生

5、物學(xué)實(shí)驗(yàn)v2、6000 rpm/min稍離稍離15 s，將反應(yīng)物置于，將反應(yīng)物置于37水浴中溫水浴中溫浴浴12 hr。v3、配膠：稱取、配膠：稱取1.4 g瓊脂糖粉末，加入瓊脂糖粉末，加入160 ml 1xTAE （配（配2瓶）瓶） ，反復(fù)煮沸三次后，待冷卻至約，反復(fù)煮沸三次后，待冷卻至約60 后，倒后，倒膠，等待凝固（約膠，等待凝固（約30 min），得到），得到1%凝膠。凝膠。v4、酶切完成后，稍離，加入、酶切完成后，稍離，加入2 l 10 x上樣緩沖液混勻，上樣緩沖液混勻，然后上樣。另上樣然后上樣。另上樣20 l Marker，以及，以及1份份10 l 質(zhì)粒質(zhì)粒（混合（混合2 l 10 x上樣緩沖液）作為對(duì)照，上樣緩沖液）作為對(duì)照，120V電泳電泳1hr。v5、在紫外分析儀（凝膠成像系統(tǒng)）上觀察酶切的結(jié)果。、在紫外分析儀（凝膠成像系統(tǒng)）上觀察酶切的結(jié)果。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)電泳檢測(cè)示例分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)g DNA(較高的甘油濃度較高的甘油濃度 )分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生