梅毒實驗室檢測

1、梅毒的實驗室診斷病原體為梅毒螺旋體，屬于密螺旋體屬，蒼白密螺旋體蒼白亞種(Treponema pallidum subspecies pallidum) 蒼白亞種 梅毒 蒼白螺旋體 地方亞種 地方性梅毒 極細亞種 雅司病密螺旋體屬 品他螺旋體 品他病梅毒螺旋體的生物學特性1、直徑、直徑 0.100.15m，有，有814個致密而規(guī)則的個致密而規(guī)則的 小螺旋，兩端尖直。小螺旋，兩端尖直。2、原生質圓柱體上緊繞著、原生質圓柱體上緊繞著34根周漿鞭毛，故運根周漿鞭毛，故運 動活躍，運動方式多樣。動活躍，運動方式多樣。3、G-，但不易著色。，但不易著色。Fantana鍍銀染色呈棕褐色。鍍銀染色呈棕褐色。

2、4、在無活細胞的人工培養(yǎng)基中難培養(yǎng)，生長慢。、在無活細胞的人工培養(yǎng)基中難培養(yǎng)，生長慢。5、抵抗力極弱，對溫度和干燥特別敏感；對青霉、抵抗力極弱，對溫度和干燥特別敏感；對青霉 素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感。在干燥條件下不易素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感。在干燥條件下不易生存。肥皂水和一般消毒劑以及加溫生存。肥皂水和一般消毒劑以及加溫42以上均極易將其以上均極易將其殺滅。殺滅。梅毒螺旋體傳播途徑 性接觸是主要的傳染途徑 未經(jīng)治療的患者在感染后的1年內最具有傳染性 隨著病期的延長，傳染性越來越小 到感染后2年，通過性接觸一般無傳染性母嬰傳播 在妊娠7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染未經(jīng)治療者，雖已

3、無性傳播（病期2年），但妊娠時仍可傳染給胎兒病期越長，傳染性越小;輸血傳染間接傳播：日常用品、接吻、哺乳、醫(yī)療器械等途徑（接觸部位附有梅毒螺旋體） 。梅毒的分期梅毒的診斷梅毒的診斷早期梅毒（一期、二期和早期隱性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隱性梅毒）必須依靠病史、癥狀及實驗檢查進行綜合分析 梅毒的實驗室檢查結果對診斷有決定性意義常用梅毒實驗室檢測方法病原學檢測病原學檢測血清學檢測血清學檢測病原學檢查取材方法一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組織液暗視野顯微鏡、鍍銀染色法和直接熒光法在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光

4、，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。白色發(fā)光，螺旋整白色發(fā)光，螺旋整齊，運動規(guī)律（齊，運動規(guī)律（旋轉、伸縮或蛇行旋轉、伸縮或蛇行運運動）動）病原學檢查的臨床意義病原學檢查的臨床意義病原學方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，且具有快速、方便、易操作的特點。 螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。 如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。梅毒血清學檢測方法梅毒血清學檢測方法梅毒血清學檢測分類梅毒血清學檢測分類n非梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （非特異性梅毒抗體）n梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體）非梅

5、毒螺旋體抗原血清學試驗原理原理（抗心磷脂抗體）：人體感染了梅毒螺旋體后，組織受到破壞，釋放出來的一種類脂成分，與梅毒螺旋體結合形成完全抗原，刺激機體產(chǎn)生類脂質抗體（反應素）。主要是IgM和IgG混合抗體?？贵w產(chǎn)生時間 感染3周-4周，硬下疳出現(xiàn)1周-2周一般在感染后57周（或硬下疳出現(xiàn)后23周）產(chǎn)生。 抗體作用無保護作用，治療監(jiān)測。未經(jīng)治療的病人，其血清內的反應素可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應素可以逐漸減少至轉為陰性。原理和方法反應原理反應原理抗原抗體結合形成復合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見抗原基本成分抗原基本成分心磷脂、卵磷脂和膽固醇方法包括：方法包括：快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗(RPR

6、)不加熱血清反應素(USR) 甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）性病研究實驗室試驗(VDRL)等。四種非特異性試驗方法比較四種非特異性試驗方法比較VDRLVDRLUSRUSRRPRRPRTRUSTTRUST抗原成分抗原成分心磷脂、卵磷心磷脂、卵磷脂、脂、 膽固醇膽固醇同前同前+EDTA+EDTA+氯氯化膽堿化膽堿同前同前+EDTA+EDTA+氯氯化膽堿化膽堿+ +活性活性炭炭同前同前+EDTA+EDTA+氯化膽堿氯化膽堿+ +甲苯胺紅甲苯胺紅抗原穩(wěn)定性抗原穩(wěn)定性不穩(wěn)定不穩(wěn)定,1,1天天穩(wěn)定穩(wěn)定4 4 8 8 保存保存1212個月個月穩(wěn)定穩(wěn)定4 4 8 8 保存保存1212個月個月穩(wěn)定穩(wěn)定4

7、4 8 8 保存保存1212個月個月血清試驗前處理血清試驗前處理需滅活需滅活不需滅活不需滅活不需滅活不需滅活不需滅活不需滅活反應板及結果反應板及結果判斷判斷玻片，肉眼或玻片，肉眼或顯微鏡顯微鏡玻片，肉眼或玻片，肉眼或顯微鏡顯微鏡紙卡片，肉眼紙卡片，肉眼紙卡片，肉眼紙卡片，肉眼注釋注釋唯一用于檢查腦唯一用于檢查腦脊液的試驗，診脊液的試驗，診斷神經(jīng)梅毒斷神經(jīng)梅毒結果容易判斷結果容易判斷結果容易判斷結果容易判斷一期敏感性一期敏感性（未經(jīng)治療）（未經(jīng)治療）74%-87%74%-87%77%-88%77%-88%77%-99%77%-99%77%-99%77%-99%二期敏感性二期敏感性（未經(jīng)治療）（未

8、經(jīng)治療）100%100%100%100%100%100%100%100%晚期敏感性晚期敏感性（未經(jīng)治療）（未經(jīng)治療）98%98%99%99%98%98%99%99%RPR/TRUST檢測流程檢測流程試驗前期準備RPR儀儀(水平旋轉儀器水平旋轉儀器) 必須滴！必須滴！試劑 50l移液器、吸頭 記號筆、廢物缸 工作服 一次性手套、口罩、帽子 生物安全柜梅毒自動旋轉儀梅毒自動旋轉儀測速:100轉/MIN （2轉）檢測流程（定性）n加樣：加樣：吸取50l血清（漿）放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內。n 加抗原加抗原：將抗原輕輕搖勻，用試劑盒提供的針頭加1滴抗原。n 反應反應：將卡片置梅毒自動旋轉儀8

9、分鐘立即在亮光下觀察結果。檢測流程（定量）n稀釋液準備：稀釋液準備：在圈內加入50l生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。n 加樣加樣：吸取50l血清(漿)與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布滿整個圈內。n 重復定性試驗后兩步。重復定性試驗后兩步。凝集反應強度分級：3+4+：圓圈內出現(xiàn)中到大的紅色絮狀物，液體清亮。2+：圓圈內出現(xiàn)小到大的紅色絮狀物，液體較清亮。1+：圓圈內出現(xiàn)小的紅色絮狀物，液體渾濁。：圓圈內僅見紅色集中于中央一點或均勻分散。RPR定量試驗定量試驗中等至大的凝塊為陽性（圈4和7）有明確但很小的凝塊為弱陽性（圈2和3）顆粒均勻分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）為陰性臨

10、床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個月，VDRL試驗抗體滴度下降2個稀釋度，6個月下降4個稀釋度。 一期梅毒1年后轉為陰性 二期梅毒2年后轉為陰性。 晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應仍為陽性早期梅毒硬下疳出現(xiàn)1周-2周后，血清可呈陽性。經(jīng)治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復發(fā)或再感染的指征。假陽性問題假陽性：非梅毒患者的血清反應呈陽性技術性假陽性技術性假陽性由于標本的保存不當（如細胞污染或溶血）、試劑質量差或過期、或實驗室操作錯誤所造成。生物學假陽性生物學假陽性是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性急性生物學

11、假陽性反應的疾病風疹風疹水痘水痘傳染性單核細胞增多癥傳染性單核細胞增多癥傳染性肝炎傳染性肝炎上呼吸道感染上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎病毒性肺炎牛痘疹牛痘疹慢性生物學假陽性反應的疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅斑狼瘡 自身免疫性溶血性貧血自身免疫性溶血性貧血盤狀紅斑狼瘡盤狀紅斑狼瘡 結節(jié)性多動脈炎結節(jié)性多動脈炎 類風濕性關節(jié)炎類風濕性關節(jié)炎 橋本氏甲狀腺炎橋本氏甲狀腺炎風濕性心臟病風濕性心臟病干燥綜合征干燥綜合征毒品癮者毒品癮者 慢性腎炎慢性腎炎肝硬化肝硬化老年老年 麻風麻風 (是唯一產(chǎn)生慢是唯一產(chǎn)生慢性生物學假陽性的感染性生物學假陽性的感染性性 疾病疾病)妊娠的假陽性反應妊娠的

12、假陽性反應這是一種生理情況下的生物學假陽性這是一種生理情況下的生物學假陽性 假陽性發(fā)生率較低有報告為假陽性發(fā)生率較低有報告為0.4%，滴度低。，滴度低。假陽性問題梅毒假陽性反應的處理梅毒假陽性反應的處理 技術性假陽性反應一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應，經(jīng)過重復試驗即可除外。 對急性生物學假陽性反應，應做TPHA（TPPA）等試驗進行排除。前帶現(xiàn)象原理原理指二期梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗中，有時血清中存在高濃度的抗體時出現(xiàn)的弱陽性、不典型或陰性反應的結果。處理處理將血清稀釋后再進行試驗。血清固定耐血清性（血清固定）指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗在一定時期內不陰轉。早期的耐血

13、清性常與治療量不足或不規(guī)則治療、復發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關。梅毒螺旋體抗原血清學試驗試驗原理試驗原理檢測血中特異性抗梅毒螺旋體特異蛋白為抗原的抗體（ IgG 和IgM ）。特異性IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染2周后即可測出。實驗方法實驗方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS） 化學發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）TPPA/TPHA原理原理TPPA試驗原理與TPHA試驗基本相同TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏

14、明膠顆粒TPHA試驗中梅毒螺旋體致敏羊紅細胞特點梅毒螺旋體(Nichols株)全抗原操作步驟1. 試劑準備：試驗前將試劑和待檢標本恢復到室溫。 2. 加稀釋液：每份樣本做4孔，加標本稀釋液加至微量反應板孔內，第1孔100微升，第24孔各25微升。3. 樣本稀釋：取血清25微升加至第1孔，混勻后取25微升至第2孔，混勻后取25微升至第3孔，混勻后取25微升至第4孔，混勻后棄去25微升。4. 加對照液：第3孔加未致敏顆粒25微升，第4孔加致敏顆粒25微升。5. 混合：將反應板置振蕩器振蕩30秒。6.反應：置有蓋濕盒，孵育2 h，或放4冰箱過夜觀察結果。結果判斷1.觀察加未致敏顆粒的第3孔，不出現(xiàn)凝

15、集為有效試驗。 2. 觀察凝集反應強度：分級如下。 4+：顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊。 3+： 顆粒光滑覆蓋大部分孔底。 2+：顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán)。 1+： 顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán)。 ：顆粒沉集孔底，中央形成一小點。 一：顆粒緊密沉積孔底中央。熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）原理將有完整形態(tài)的梅毒螺旋體作為抗原，加上經(jīng)吸收劑（用Reiter螺旋體制備而成）吸收過的梅毒患者血清形成抗原抗體復合物，再加入異硫氰酸熒光素（FTIC）標記的抗人免疫球蛋白，與抗梅毒螺旋體抗體結合，形成熒光的抗原抗體復合物。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯出蘋果綠色的熒光，即

16、為陽性反應。曾經(jīng)認為FTA-ABS試驗是檢測梅毒的“金標準”試驗。TP-ELISA原理原理用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標記物，形成抗原抗體復合物與酶標記物結合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應。特點本法可用于大規(guī)模血清檢測。免疫層析臨床應用臨床應用梅毒螺旋體試驗的作用是作為證實試驗它們可以幫助確定非梅毒螺旋體試驗陽性反應是真陽性還是假陽性。 一旦這些試驗呈陽性，則患者終身陽性。方法特點方法特點特異性強，敏感性高很少出現(xiàn)假陽性。據(jù)統(tǒng)計，在普通人群中，有有1%的生物學假陽性發(fā)生。n 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可使FTA-ABS試驗呈假陽性反應，但大多數(shù)病例中螺旋體呈串株狀

17、熒光。n 傳染性單核細胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPHA呈假陽性。麻風患者也可使特異試驗呈陽性。臨床意義臨床意義作為RPR初篩陽性標本的確證試驗。不能作為療效觀察的指標。陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應結合RPR結果進行診斷。假陽性問題存在交叉反應的抗體處理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反應的抗體。老年人抗體陽性的問題1、真陽性 2 、假陽性：這些老年患者所患的基礎疾病可能使機體釋放誘導產(chǎn)生抗類脂抗體和/或抗T.pallidum抗體的交叉抗原；梅毒血清學試驗結果解釋梅毒血清學試驗結果的臨床意義RPRTRUSTTPPATP-ELISA臨床意義陰性陰性排除梅毒排除梅毒（一期梅毒

18、的早早期）（一期梅毒的早早期）陽性陽性現(xiàn)癥梅毒現(xiàn)癥梅毒(梅毒孕婦所生的嬰兒除外梅毒孕婦所生的嬰兒除外)陽性陰性生物學假陽性生物學假陽性陰性陽性早期梅毒經(jīng)治療后早期梅毒經(jīng)治療后（早期梅毒）（早期梅毒）RPR結果解釋示意圖治療前治療后早期一期二期早期潛伏晚期晚期潛伏三期 陽性陽性 陰陰性性TPPA結果解釋示意圖治療前治療后早期一期二期早期潛伏晚期晚期潛伏三期 陽性陽性 陰性陰性梅毒血清學試驗適用范圍檢 測 方 法 樣 品 種 類 血清 血漿 末梢血 腦脊液非梅毒螺旋體試驗非梅毒螺旋體試驗 快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 (RPR)(RPR) 甲苯胺紅不加熱血清試驗（甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUSTTRUST） 性病研究實驗室試驗 (VDRL) 梅毒螺旋體試驗梅毒螺旋體試驗 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA)(TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISATP-ELISA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (TP-RT) 熒光梅毒螺旋體