乳鼠心成纖維細胞波形蛋白和線粒體表達的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

1、乳鼠心成纖維細胞波形蛋白和線粒體表達的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 作者：王春梅郭海濤楊家冀黃曉峰陳丹朱妙章 【關(guān)鍵詞】 成纖維細胞 關(guān)鍵詞: 成纖維細胞;細胞骨架;線粒體;激光掃描共聚焦顯微鏡;大鼠 摘 要:目的 用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察培養(yǎng)的乳鼠心成纖維細胞中細胞骨架波形蛋白（vimentun，Vim）、線粒體（mitochondrial，Mi）以及相互關(guān)系. 方法 分離純化乳鼠心成纖維細胞，免疫熒光雙標記技術(shù)進行了Vim和Mi的標記，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察. 結(jié)果 培養(yǎng)的乳鼠心成纖維細胞中Vim位于細胞的胞質(zhì)中，呈粗細不等的綠色線條狀或絲狀分布，標記明顯，許多細絲交織形成網(wǎng)狀

2、結(jié)構(gòu).Mi標記為紅色顆粒狀，遍布于細胞質(zhì)中，Mi的顆粒大小不等，形態(tài)不一，可聚集成團，并有明顯的沿著Vim分布的趨勢. 結(jié)論 LSCM觀察培養(yǎng)的心成纖維細胞中Vim呈細絲交織形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Mi有沿著細胞骨架Vim分布的趨勢. Keywords:fibroblasts;cytoskeleton;mitochondrion;laser scanning confocal microscope;rats 1 / 9Abstract:AIM To observe the vimentin（Vim），mitochon-drion（Mi）and their interrelationships in

3、 the cultured cardiac fibroblast of rat with laser scanning confocal microscope.METHODS The cardiac fibroblasts of rat underwent double labeling of Vim and Mi by immunofluorescence technique after isolation and purification，then were observed with laserscanning confocal microscope.RESULTS Vim was ob

4、served in the cytoplasm of cardiac fibroblast of rat clearly，with a distribution of irregular green lines or fila.Most of them dis-played reticular formation.Mi were the red granules，which were universally distributed in the cytoplasm.The size and shape were irregular，either gathered in a mass or di

5、stributed along Vim.CONCLUSION Laser scanning confocal micro-scopic observation reveals that Vim is filament-like and can display reticular formation and Mi might be distributed along Vim. 0 引言 激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域1，2 .但是對于心成纖維細胞中細胞骨架觀察未見報道.了解心成纖維細胞增殖和功能

6、的變化特征，尤其是細胞骨架的分布與變化及與能量供給單位-線粒體的關(guān)系，對采取及時的防治措施是十分重要的3 .我們采用免疫熒光雙標記技術(shù)對培養(yǎng)的心成纖維細胞進行了波形蛋白（vimentun，Vim）和線粒體（mitochondrial，Mi）的標記，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了形態(tài)和分布以及相互的關(guān)系.旨在探討正常培養(yǎng)的心成纖維細胞中Vim和Mi的定性、定位，以及相互的關(guān)系，為進一步研究心成纖維細胞的病理變化提供實驗依據(jù). 1 材料和方法 1.1 材料 SD乳鼠（12d）:由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供.胰酶:Difco，膠原酶:EDTA，DMEM培養(yǎng)基及小牛血清:Gibco;線粒體標記物Mit

7、o-Tracker（Gene Co Ltd110000），波形蛋白標記物（Dako Vimentun150），羊抗小鼠IgG-FITC. 1.2 方法 心成纖維細胞培養(yǎng)與鑒定與郭海濤等4 方法相同.將載有心成纖維細胞的蓋玻片pH7.4的PBS（37）沖洗12min3次，加入MitoTracker（37）1545min，pH7.4的PBS沖洗3次，用4丙酮固定1015min.pH7.4的PBS沖洗3次，加鼠抗波形蛋白4560min37或4過夜.pH7.4的PBS洗3次，加FITC標記的羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程公司，稀釋度150）37孵育4560min或4過夜.pH7.4的PBS洗3次，

8、無熒光緩沖甘油封片.對照用無關(guān)抗體以及正常兔血清取代一抗染色作為抗體特異性對照，用PBS替代一抗作為陰性對照，省略一抗作空白對照.所用LSCM型號為Bio-Rad MRC-1024，用于FITC的激發(fā)波長為488nm，568nm用于激發(fā)Mi.用于圖像采集的顯微鏡物鏡為Plan-Neofluar40×油浸鏡，數(shù)值孔徑（NA）為1.3.圖像存為512×512相素類型.ZOOM設(shè)為1.0.若需要更大的放大倍數(shù)時，可以選擇更大的ZOOM范圍.掃描所用的激發(fā)值依據(jù)樣本的不同可以在共聚焦系統(tǒng)提供的梯級值中選擇. 2 結(jié)果 2.1 心成纖維細胞波形蛋白 呈粗細不等的綠色線條狀或絲狀分布，

9、標記明顯，位于細胞的胞質(zhì)中，單個細胞的許多細絲交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（Fig1）. 2.2 心成纖維細胞線粒體 標記為紅色顆粒狀，遍布于細胞質(zhì)中，線粒體的顆粒大小不等，形態(tài)不一，可聚集成團（Fig2）. 2.3 波形蛋白與線粒體雙標記 線粒體有明顯的沿著細胞骨架波形蛋白分布的趨勢，局部可見到大小不等，形狀不規(guī)則的團塊，為波形蛋白綠色線條狀細絲與紅色顆粒在重疊處為黃色斑塊狀（Fig3）. 圖1 圖3 略 3 討論 心臟是人體的重要器官，由心肌細胞和幾種非心肌細胞（成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞）構(gòu)成，非心肌細胞占心臟細胞總數(shù)的三分之二，其中90%以上是成纖維細胞.雖然嬰兒出生后心肌細胞立即喪失增殖能

10、力，但是，非心肌細胞仍然增殖，甚至在成人心臟仍有增殖的報道 5，6 .心臟受損發(fā)生病理改變，可導(dǎo)致心成纖維細胞增殖.Vim是細胞骨架纖維蛋白之一，屬中間絲蛋白，是細胞早期增殖、分化的標志之一，同時在保持細胞形態(tài)和位置方面有很大的作用.轉(zhuǎn)錄活躍的心成纖維細胞中細胞骨架與功能相適應(yīng)，非正常的增殖和膠原合成的增加是高血壓和心肌梗死后心室重朔、心肌肥大及纖維化等心血管病理過程的重要環(huán)節(jié).因此了解心成纖維細胞增殖和功能的變化特征，尤其是細胞骨架的分布與變化及與能量供給單位-線粒體的關(guān)系，對采取及時的防治措施是十分重要的. 線粒體作為一個重要的細胞器普遍存在于幾乎所有的真核細胞中（除外成熟紅細胞），其主要

11、的代謝功能是進行氧化磷酸化為細胞提供能量，是細胞呼吸代謝中心和細胞內(nèi)ATP的主要源泉，與細胞的生命活動有著非常密切的關(guān)系.線粒體的形狀、數(shù)目、大小和功能隨環(huán)境發(fā)生變化，在細胞發(fā)育過程中，線粒體是能夠最早反映細胞分化趨勢的細胞器之一.在分化趨勢旺盛和功能活躍的細胞中線粒體明顯增多. 本實驗采用免疫熒光雙標記技術(shù)對培養(yǎng)的乳鼠正常心成纖維細胞進行的Vim和Mi標記，LSCM觀察結(jié)果表明，心成纖維細胞Vim位于細胞的胞質(zhì)中，呈粗細不等的綠色線條狀或絲狀分布，標記明顯，單個細胞的許多細絲交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).Mi標記為紅色顆粒狀，遍布于細胞質(zhì)中，Mi的顆粒大小不等，形態(tài)不一，有明顯的沿著細胞骨架Vim分布的

12、趨勢，可以推測與細胞運動中的能量供給有關(guān).心成纖維細胞的Vim病理性增殖變化以及與Mi的分布關(guān)系有待進一步研究. 參考文獻: 1Wang CM，Huang XF，Pan BR，Dai XW，Ma FC，Zao YL.Ex-pression of chromogranin C/secretograninand pancreastatin in pancreatic ductal carcinoma J.Shijie Huaren Xiaohua Za-zhi（World Chin J Digestol），1998;6（6）:470-473. 2Wang CM，Huang XF，Yang JJ，H

13、uang M，Li XD，Chen D.Coexistence of adrenocorticotropin and secretograninin the rat pituitary gland after brain injury J.Shenjing Jiepou Zazhi（Chin J Neuroanatomy），2000;16（4）:337-340. 3Zhu YZ.Distribution of vimentin in normal and cardiac mutant axolotl embryonic hearts by confocal laser scanning microscopy J.Jiepouxue Zazhi（Chin J Anatomy），1999;22（5）:423-425. 4Guo HT，Zhu MZ.Vasonatrin peptide attenuates hypoxia-in-duced expression in Ca2+ I of cultured rat cardiac fibroblasts J.Acta Physiol Sinica，2001;53（4）:286-290. 5Kim Ho-dirk.Ex