臨床基因擴增檢驗標(biāo)本的處理、保存和核酸提取方法及質(zhì)量控制3

1、臨床基因擴增檢驗標(biāo)本的處理、保存臨床基因擴增檢驗標(biāo)本的處理、保存和核酸提取方法及質(zhì)量控制和核酸提取方法及質(zhì)量控制童永清童永清武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心核酸擴增檢測標(biāo)本核酸擴增檢測標(biāo)本采集、運輸、存儲的重要性采集、運輸、存儲的重要性n臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)n解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一核酸提取的重要性核酸提取的重要性n核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分n核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗的正確與

2、否n臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)分析前質(zhì)量控制分析前質(zhì)量控制標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運、預(yù)處理、儲存等標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運、預(yù)處理、儲存等n標(biāo)本采集、運送和保存標(biāo)本采集、運送和保存p早早 特別是對用于病毒分離、抗原或核酸檢測的標(biāo)本特別是對用于病毒分離、抗原或核酸檢測的標(biāo)本p快快 標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，不能及時檢測的標(biāo)本放入低溫容器內(nèi)送檢。短時標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，不能及時檢測的標(biāo)本放入低溫容器內(nèi)送檢。短時 間可低溫保存，凍存的標(biāo)本忌反復(fù)凍融間可低溫保存，凍存的標(biāo)本忌反復(fù)凍融p近近 標(biāo)本應(yīng)盡量取自病變部位或接近病變部位標(biāo)本應(yīng)盡量取自病變部位或接近病變部位p多多 標(biāo)本的量不能太少標(biāo)本的量不能太少p凈凈 避免污染標(biāo)本避免

3、污染標(biāo)本標(biāo)本采集標(biāo)本采集n標(biāo)本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響 n標(biāo)本采集部位的準備 n標(biāo)本的類型和采集量 n采樣質(zhì)量的評價 n采樣及運輸容器 n標(biāo)本采集中的防污染 標(biāo)本運送標(biāo)本運送 n樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室。n樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。n實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。檢測標(biāo)本類別檢測標(biāo)本類別全血標(biāo)本標(biāo)本血漿血清骨髓骨髓活檢活檢組織組織腹水腹水胸水胸水石蠟石蠟切片切片分泌分泌物物新鮮新鮮組織組織毛囊有目有目的地的地選擇選擇標(biāo)本標(biāo)本類別

4、類別標(biāo)本采集器皿標(biāo)本采集器皿標(biāo)本采集器標(biāo)本類型決定標(biāo)本采集器n標(biāo)本采集標(biāo)本采集n外周血（外周血（HBV/EBV-DNA、HCV-RNA、HLA分型等分型等 ）p抗凝劑使用：首選抗凝劑使用：首選EDTA或枸櫞酸鈉，不可使用肝素（強烈抑制或枸櫞酸鈉，不可使用肝素（強烈抑制PCR反應(yīng)），不可溶血反應(yīng)），不可溶血pRNA 檢測：及時分離血漿，置于無檢測：及時分離血漿，置于無RNase 的離心的離心管中送檢管中送檢pEBV-DNA檢測檢測（小心使用）（小心使用）：小心分離：小心分離LC，避免混入，避免混入RBCn標(biāo)本采集標(biāo)本采集n其他體液（其他體液（TB/EBV-DNA等病原）等病原）n痰：深部痰液，不

5、是唾液痰：深部痰液，不是唾液n胸腹水：無菌抽取，加抗凝劑胸腹水：無菌抽取，加抗凝劑n尿液：尿道口消毒，中段尿尿液：尿道口消毒，中段尿n鼻咽部：咽后壁分泌物鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNAn分泌物（分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）等病原）n采樣時要采到上皮細胞采樣時要采到上皮細胞n充分洗滌拭子充分洗滌拭子切片組織標(biāo)本采集切片組織標(biāo)本采集n腫瘤組織40%：直接提取核酸n腫瘤組織血清血清10倍）倍）2、陰性結(jié)果解讀：、陰性結(jié)果解讀：DNA陰性并非無感染，判斷陰性并非無感染，判斷 是否感染是否感染 需要進行需要進行HBsAg檢測檢測3、什么時候需要檢測、什么時候需要檢測HBV-DNA：a、

6、 HBsAg(+)，需要判斷，需要判斷HBV在體內(nèi)復(fù)制情況在體內(nèi)復(fù)制情況b、乙型肝炎患者在治療過程中療效監(jiān)測、乙型肝炎患者在治療過程中療效監(jiān)測大三陽患者HBV-DNA陰性率5-10%小三陽患者HBV-DNA陰性率30%左右48丙型肝炎流行丙型肝炎流行n丙型肝炎呈全球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因n全球約1.2億人感染HCV,流行率2%n我國HCV的感染率約為3.2%，約3800萬HCV感染者n每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例-WHO 丙型肝炎檢測丙型肝炎檢測注意事項：注意事項：a、血漿血漿、血清、血清b、及時送檢，不能及時檢測時，放置與、及時送檢，不能及時檢測時，放置與-20

7、c c、抗體檢測陽性時，、抗體檢測陽性時，HCV-RNA(+),有感染；抗體有感染；抗體檢測陰性時，不一定未感染，需檢測檢測陰性時，不一定未感染，需檢測HCV-RNA 腫瘤的分子診斷腫瘤的分子診斷實例實例2N Engl J Med. 2011; 365:158-167非小細胞肺癌分子分型非小細胞肺癌分子分型Mod Pathol. 2008;21 Suppl 2:S16-22Mod Pathol. 2012;25(3):347-69J Clin Oncol. 2013;31(8):1081-8不同化療方案之間的療效不同化療方案之間的療效組織標(biāo)本的質(zhì)量控制組織標(biāo)本的質(zhì)量控制組織足夠組織足夠 HE染色，形態(tài)學(xué)檢測染色，形態(tài)學(xué)檢測組織量不夠時組織量不夠時 (1)基因檢測：基因檢測：EGFR、ALK等等 (2)免疫組化：區(qū)分腺癌和鱗癌，同時鑒別是否轉(zhuǎn)移免疫組化：區(qū)分腺癌和鱗癌，同時鑒別是否轉(zhuǎn)移 和其它類型的肺癌和其它類型的肺癌 p63（鱗癌）；（鱗癌）； CEA, B72.3, Ber-EP4, MOC31, CD15, and TTF-1（腺癌）（腺癌） CD56, chromogranin, synapt