實(shí)驗(yàn)二血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 血紅蛋白及其衍生物血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及定量測定的吸收光譜及定量測定 一、目的要求一、目的要求1、掌握、掌握722型分光光度計(jì)的使用。型分光光度計(jì)的使用。2、了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測、了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測定。定。3、掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。、掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。二、實(shí)驗(yàn)原理 血紅蛋白Hb與O2結(jié)合生成氧合血紅蛋白HbO2），與CO結(jié)合生成一氧化碳血紅蛋白HbCO），因其血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)光線分別透過各種Hb溶液時(shí)，所吸收的光波也各異，可顯出特有的吸收光譜。這些吸收光譜可作為它們定性和定量分析的基礎(chǔ)，如HbO2在可見光波長400

2、600nm范圍內(nèi)有三個(gè)特征的吸收峰，其峰值分別在415、541和576nm處，當(dāng)氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)為一氧化碳血紅蛋白HbCO），此時(shí)光譜發(fā)生改變，在波長419、540和569nm處出現(xiàn)三個(gè)特征的吸收峰，其中在500600nm范圍內(nèi)三個(gè)特征的吸收峰如下圖。三、儀器和試劑三、儀器和試劑 1儀器：試管及試管架；吸量管；滴管和 量筒；722型分光光度計(jì)；CO發(fā)生器。2試劑： （1） 濃H2SO4； （2甲酸； （3蒸餾水； （4血紅蛋白溶液。 722型分光光度計(jì)能在可見光譜區(qū)域內(nèi)對樣品物質(zhì)作定量的分析。該儀器廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床檢驗(yàn)、生物化學(xué)、石油化工、環(huán)境保護(hù)、質(zhì)量控制等部門，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用分

3、析儀器之一1 1、722722型分光光度計(jì)的使用型分光光度計(jì)的使用基本原理基本原理 溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收 的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不 同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色 光通過溶液時(shí)，其能量就會被吸收而減弱，光能量光通過溶液時(shí)，其能量就會被吸收而減弱，光能量 減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即 符合于比色原理符合于比色原理-朗伯朗伯-比耳定律比耳定律 u 朗伯

4、比爾定律：朗伯比爾定律： A=lc ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù) c：溶液的濃度：溶液的濃度 l：液層的厚度：液層的厚度 A：物質(zhì)的吸光度：物質(zhì)的吸光度 操作方法操作方法u 預(yù)熱儀器預(yù)熱儀器 u 選定波長選定波長 u 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)T=100 u 固定靈敏度檔固定靈敏度檔 u 調(diào)理調(diào)理“0點(diǎn)點(diǎn) u 測定測定 u 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī) 本卷須知本卷須知u 該儀器應(yīng)放在干燥房間內(nèi)，使用溫度為該儀器應(yīng)放在干燥房間內(nèi)，使用溫度為535。u 遠(yuǎn)離強(qiáng)電場、磁場遠(yuǎn)離強(qiáng)電場、磁場u 每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿 u 為了防止光電管疲勞。不測定時(shí)必須將比色皿為了防止光電管疲勞。不測定時(shí)必須將比

5、色皿u 暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命命 u 當(dāng)儀器停止工作時(shí)，切斷電源，電源開關(guān)同時(shí)u 切斷。并且用套子蓋住儀器，做好使用登記 u 比色皿的使用方法 拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污不要碰比色皿的透光面，以免沾污 洗比色皿時(shí)，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈洗比色皿時(shí)，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈 比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙蘸干，比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙蘸干，以保護(hù)透光面以保護(hù)透光面 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 1樣品的制備： 用草酸

6、鉀抗凝，取靜脈血，邊取邊輕輕搖動，即制得全血。 （1氧合血紅蛋白HbO2液：加蒸餾水20ml， 取全血0.1ml3滴盛于小燒杯中，混勻，此即HbO2液，呈鮮紅色。（2碳氧血紅蛋白HbCO) 液：取上述HbO2液約5ml于試管中，通CO氣體濃硫酸與甲酸在CO發(fā)生器中反應(yīng)發(fā)生約10秒鐘，HbO2即變成櫻桃紅色的HbCO溶液。 2吸光度測定及吸光光譜曲線的繪制： （1將如上制備的2種血紅蛋白液分別盛于比色杯內(nèi)，在722型分光光度計(jì)上以蒸餾水為空白調(diào)節(jié)吸光度零點(diǎn)和100%（每一次讀數(shù)均應(yīng)用空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)和100%）。 （2） 先從波長500600nm分別測定HbO2，碳氧血紅蛋白的吸光度在相應(yīng)峰值的10nm范圍內(nèi)每隔2nm記錄一次吸光度讀數(shù)，其余均每隔10nm記錄一次吸光度讀數(shù)）。 （3然后以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)描點(diǎn)，并將各點(diǎn)連接成曲線，即為血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜，但由于使用儀器不同，繪制出的血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜必有一些差異，對722型分光光度計(jì)來說，峰值誤差在3nm5nm