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1、環(huán)境微生物多樣性觀察徐萍(南京師范大學(xué),教師教育學(xué)院)摘要:本文著重于環(huán)境微生物的觀察。主要從以下四步來(lái)完成:環(huán)境微生物的采集與分離、不同微生物類群菌落的比較及細(xì)菌多樣性的觀察與鑒定、放線菌、真菌、霉菌高等真菌形態(tài)觀察、自然界中噬菌體的分離。通過(guò)以上階段性的研究學(xué)習(xí)微生物采集、分離、菌落鑒定等基本實(shí)驗(yàn)室操作方法;樹(shù)立無(wú)菌意識(shí)。前言微生物在自然界中可以說(shuō)是無(wú)處不在。不管我們生活的周圍環(huán)境,還是我們體內(nèi)都有大量微生物的存在,微生物不光分布廣,而且種類繁多,數(shù)目龐大,讓我們無(wú)法想象。我們每時(shí)每刻都在與微生物打交道,所以微生物與人類的關(guān)系非常密切。到底微生物與人類有著怎樣的關(guān)系?實(shí)際上微生物與人類的關(guān)
2、系有兩個(gè)方面:有對(duì)人類有益的一面,也有對(duì)人類有害的一面。一、 微生物與人類日常生物人類要生存,就必須有食物。我們每天吃的很多的食品的制作都離不開(kāi)微生物。比如:我們每天吃的饅頭、面包、泡菜等食品。我們喝的營(yíng)養(yǎng)豐富的酸奶;各種酒類-調(diào)味品中的醋、醬油它們都是經(jīng)過(guò)微生物的發(fā)酵制作出來(lái)的。還有我們吃的營(yíng)養(yǎng)豐富的菌類,如各種蘑菇、木耳,銀耳。還有藥用價(jià)值的靈芝,冬蟲(chóng)夏草也微生物。二、 微生物與人類健康在人體腸道中有很多微生物,其中要有大腸桿菌,乳酸桿菌等,這些細(xì)菌生活在人的腸道中能合成核黃素,維生素k等多種維生素以及氨基酸,以供人體吸收利用。三、 微生物與農(nóng)、牧植物生長(zhǎng)需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),腐生性微生物能
3、將人、畜糞便、植物枯枝落葉分解,并能轉(zhuǎn)換成植物能夠吸收利用的養(yǎng)料。如果沒(méi)有這些微生物,植物就會(huì)由于沒(méi)有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而無(wú)法正常生長(zhǎng)發(fā)育。有的微生物能將空氣中的氮,轉(zhuǎn)化成植物可以吸收的含氮物質(zhì)。這樣可以減少對(duì)農(nóng)作物的施肥量。如根瘤菌。四、 微生物與環(huán)境近年來(lái)隨著人口的劇增,工業(yè)的迅速發(fā)展,環(huán)境受到了嚴(yán)重的污染。其中水域的污染是非常嚴(yán)重的。以前清澈見(jiàn)底,魚蝦嬉戲的景象再也看不見(jiàn)了。很多河流都變成了臭氣熏天的臭水河。有些水域會(huì)出現(xiàn)赤潮。這都是水域受到嚴(yán)重污染的結(jié)果。水域污染治理的方法很多,在眾多的污水、廢水處理方法中,生物學(xué)的處理方法具有經(jīng)濟(jì)方便,效果好的突出優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。有些微生物能將水中的含碳
4、有機(jī)物分解成二氧化碳等氣體。將含氮有機(jī)物分解成氨,硝酸等物質(zhì)。將汞、砷等對(duì)人體有毒的重金屬鹽在水體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,以便回收或除去。在以后的污水處理。五、 微生物與自然界的物質(zhì)循環(huán)地球上每年都有大量的動(dòng),植物死亡,腐生性微生物會(huì)把這些動(dòng)植物遺體分解,并能轉(zhuǎn)換成植物能吸收和利用的養(yǎng)料從而促進(jìn)了自然界的物質(zhì)循環(huán)。試想,自然界中如果沒(méi)有這些微生物,那么地球上的動(dòng)植物遺體早就堆積如山了。那么我們?nèi)祟悓?huì)由于沒(méi)有生存空間而無(wú)法在地球上生存、繁衍。1微生物無(wú)處不在,也與我們?nèi)祟惷芮邢嚓P(guān),所以我們有什么理由不去研究微生物呢?讓我們一起走進(jìn)微生物奇妙王國(guó)吧!1環(huán)境微生物的采集與分離1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猸h(huán)境與微生物的關(guān)
5、系及其多樣性;學(xué)習(xí)環(huán)境微生物(土壤、水體、人體等)采樣的基本方法;初步掌握觀察微生物的實(shí)驗(yàn)方法;了解光學(xué)顯微鏡顯微觀察的基本操作和油鏡頭的使用方法; 了解并熟悉微生物的稀釋涂布分離方法與技術(shù);樹(shù)立嚴(yán)格的無(wú)菌意識(shí)和掌握正確的無(wú)菌操作方法。1.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法天然環(huán)境微生物樣品的采集、分離、培養(yǎng)1.2.1環(huán)境微生物樣品采集(分組采集) 空氣中微生物采集:牛肉膏蛋白胨平板和馬鈴薯培養(yǎng)基,打開(kāi)皿蓋在空氣中暴露5min后蓋上皿蓋(全班室外和室內(nèi)各一個(gè))。 土壤微生物采集:五點(diǎn)對(duì)角法取樣,混勻,稱取1 g土壤放入含9 ml無(wú)菌水的三角瓶中(內(nèi)含玻璃珠數(shù)粒),振蕩分散。 水體微生物采集與稀釋:用滅菌三角瓶分
6、別取污水和水庫(kù)水約100 ml。1. 2.2樣品稀釋土壤樣品的稀釋:稱量2 g土壤放入含18 ml無(wú)菌水的三角瓶中(內(nèi)含玻璃珠數(shù)粒),混勻后用移液槍和槍頭在離心管中進(jìn)行10倍比逐級(jí)稀釋成10-2,10-3的梯度樣品。 水體微生物樣品的稀釋:將污水和潔凈水, 分別稀釋成10-1,10-2, 10-3等系列。土壤加入水后已稀釋了10倍!0.1ml 樣品0.9ml 無(wú)菌水逐級(jí)稀釋的樣品要混勻!1.2.3樣品的平板稀釋涂布取100l稀釋液于固體培養(yǎng)基平板表面中央,用無(wú)菌的玻璃涂棒將樣品液滴均勻涂布分散在平板表面。土壤樣品:10-2,10-3樣液(單號(hào)組10-2,雙號(hào)組10-3)1塊 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基
7、1塊 高氏一號(hào)培養(yǎng)基1塊 馬鈴薯培養(yǎng)基水體樣品:庫(kù)水:10-1,10-2, 污水:10-2,10-3樣液(單號(hào)組庫(kù)水,雙號(hào)組污水)2塊 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 涂布時(shí)要涂至培養(yǎng)基表面略干為止!1.2.4培養(yǎng)將平板倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基: 30 24 h 高氏一號(hào)培養(yǎng)基: 28 1 week 馬鈴薯培養(yǎng)基上: 28 1 week 下周每個(gè)班提前一天課前半小時(shí)轉(zhuǎn)接斜面, 培養(yǎng)。無(wú)菌操作使用滅菌器材取水和土樣;使用酒精燈灼燒實(shí)驗(yàn)器材;使用酒精燈火焰制造局部無(wú)菌環(huán)境,甚至使用超凈工作臺(tái)。1.3口腔微生物的觀察1.31取樣:用無(wú)菌棉簽在口腔內(nèi)反復(fù)擦拭幾遍,然后將棉簽涂布于載玻片上(事
8、先放1/3滴水)。1.3.2制片(單染色法) 涂片固定沙黃染色2分鐘水洗至無(wú)色流液吸去殘留水酒精燈干燥。1.3.3顯微鏡油鏡觀察:按照低倍-高倍-油鏡的順序進(jìn)行觀察。油鏡:擦鏡紙擦去鏡頭上的油,擦鏡紙沾取二甲苯擦拭鏡頭,干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯??偨Y(jié).移液槍的正確使用二.養(yǎng)成良好的無(wú)菌操作的意識(shí)1.涉及到的實(shí)驗(yàn)材料要滅菌(水、槍頭、涂棒、接種環(huán)等)2.手要用75%的酒精擦拭3.盡量靠近在酒精燈邊操作三.稀釋涂布操作1.涂棒滅菌和冷卻 2.涂布要均勻四.人體微生物的采集和觀察1.涂片要薄而均勻 2.固定溫度不能高,以免影響細(xì)胞形態(tài) 3.染色后水洗要輕五.顯微鏡的使用,油鏡正確使用六.菌種的轉(zhuǎn)接
9、1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果口腔微生物觀察2不同微生物類群菌落的比較及細(xì)菌多樣性觀察與鑒定2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌、放線菌以及霉菌的群體形態(tài)及 培養(yǎng)特征2.了解革蘭氏染色原理,掌握革蘭氏染色技術(shù)3.熟悉細(xì)菌芽孢和莢膜的染色方法4.初步掌握平板菌落轉(zhuǎn)接平板及固體斜面的菌種純化方法5.初步學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)以及活菌檢測(cè)的方法2.2實(shí)驗(yàn)材料1.光學(xué)顯微鏡,載玻片,接種環(huán),酒精燈,無(wú)菌蓋玻片;2.結(jié)晶紫,沙黃,無(wú)水酒精,碘液,蒸餾水;3.實(shí)驗(yàn)一分離培養(yǎng)的各種細(xì)菌平板、放線菌平板和真菌平板;4.牛肉膏蛋白胨固體斜面,高氏一號(hào)和馬鈴薯培養(yǎng)基平板。2.3實(shí)驗(yàn)材料1. 大腸桿菌Escherichia coli (標(biāo)準(zhǔn)的
10、G-細(xì)菌)2.金黃色葡萄球菌Staphyloccus aureus (標(biāo)準(zhǔn)的G+細(xì)菌)3.硅酸鹽細(xì)菌 (供莢膜染色對(duì)照用)4.自己轉(zhuǎn)接未知菌株2.4實(shí)驗(yàn)方法(一)細(xì)菌平板菌落的斜面轉(zhuǎn)接:提前24小時(shí)實(shí)驗(yàn) 用無(wú)菌接種環(huán)挑取實(shí)驗(yàn)一從環(huán)境中分離得到的平板單個(gè)菌落劃線接種于牛肉膏蛋白胨的試管斜面上,每組挑取2個(gè)菌落(被挑選的菌落在轉(zhuǎn)接前用記號(hào)筆在平板底部作好標(biāo)記,以防混淆。被接種的細(xì)菌斜面做好標(biāo)記,放置37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),供第二天細(xì)菌染色及形態(tài)學(xué)觀察。(二) 細(xì)菌染色及顯微鏡觀察與鑒定1.細(xì)菌的革蘭氏染色1)制片:在一塊干凈載玻片上的三個(gè)區(qū)域各滴加一小滴蒸餾水,分別挑取前一天細(xì)菌分離平板上單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接培
11、養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物,和兩支革蘭氏染色標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌斜面的菌苔與上述水滴混勻,制作成薄薄的細(xì)菌涂片。將此細(xì)菌涂片在酒精燈上方通過(guò)5-6次,以使干燥的細(xì)菌樣品能夠被固定在載玻片上。2)初染:在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液,染1min,傾去染液,流水沖洗至無(wú)紫色(進(jìn)行細(xì)菌芽孢的觀察)。3)媒染:先用新配的路哥氏碘液沖去殘水,而后用其覆蓋涂面1min,后水洗。4)脫色:除去殘水后,滴加95%乙醇進(jìn)行脫色到留下的乙醇無(wú)紫色為止(約2030s),后立即用流水沖洗。5)復(fù)染:滴加番紅染色液,染35 min,水洗后用吸水紙吸干。 6)鏡檢:遵循低倍-高倍-油鏡的順序依次觀察顯微鏡視野中的細(xì)菌樣品和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的顏色
12、(藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,紅色為革蘭氏陰性細(xì)菌)。觀察染色結(jié)果并繪圖 (拍照)。2.細(xì)菌的芽孢染色(在革蘭氏染色時(shí)觀察) 1) 制片:細(xì)菌制片方法與革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)相同,分別挑取實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌分離平板上的單個(gè)細(xì)菌斜面的菌苔與上述水滴混勻,制作成薄薄的細(xì)菌涂片。將此細(xì)菌涂片在酒精燈上方通過(guò)5-6次,以使干燥的細(xì)菌樣品能夠被固定在載玻片上。 2)染色:使用沙黃或結(jié)晶紫對(duì)細(xì)菌樣品染色2分鐘,水洗去除染液,吸水紙輕輕擦拭水滴,然后在酒精燈上方進(jìn)行干燥。 3)鏡檢:分別用高倍鏡和油鏡觀察,可以看到菌體顯示藍(lán)紫色或紅色,而細(xì)胞里面的芽孢則顯示為無(wú)色透明。(三)細(xì)菌、放線菌與真菌的平板菌落特征觀察2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果芽
13、孢莢膜陽(yáng)性菌 金黃色葡萄球菌霉菌菌落插片培養(yǎng)放線菌菌落3 放線菌、霉菌的形態(tài)多樣性觀察及酵母細(xì)胞的顯微測(cè)量和直接計(jì)數(shù)3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆啪€菌、絲狀真菌以及酵母菌顯微結(jié)構(gòu)的觀察了解絲狀細(xì)菌和真菌的群落特征與細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的區(qū)別;掌握測(cè)定微生物細(xì)胞大小的測(cè)微技術(shù);掌握對(duì)單細(xì)胞微生物進(jìn)行顯微直接計(jì)數(shù)的方法3.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)二插片培養(yǎng)的放線菌平板與霉菌平板;實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌種:曲霉,青霉,根霉示范片;釀酒酵母菌懸液。顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、解剖針、解剖刀、酒精燈、鑷子等。鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺、血球計(jì)數(shù)板3.3酵母菌顯微直接計(jì)數(shù) 方法:活菌計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法;總菌計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板或霍瑟細(xì)菌計(jì)數(shù)板取清潔無(wú)油的血球計(jì)數(shù)板,在計(jì)數(shù)室上面加蓋血蓋片。 取酵母菌液,搖勻,用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴,使菌液自行滲入,計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。用10×鏡觀察并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。 在10×鏡下計(jì)數(shù):計(jì)數(shù)4個(gè)(或5個(gè))中格的平均值,然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上16(或25)就得出計(jì)數(shù)區(qū)總菌數(shù),最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。注意事項(xiàng):計(jì)上不計(jì)下,計(jì)左不計(jì)右。出芽計(jì)一半3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果放線菌菌絲霉菌根絲黑曲霉菌絲青霉菌絲黑根霉孢子梗黑曲霉菌絲黑根霉孢子囊校準(zhǔn)大腸桿菌計(jì)數(shù)4自然界中噬菌體的分離4.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解從環(huán)境污水中分離噬菌體的普通原理;2.熟悉并掌握噬菌體的擴(kuò)增、培養(yǎng)
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