無菌檢測標準操作規(guī)程(培養(yǎng)法)

1、無菌檢測標準操作規(guī)程Standard Operating Procedure of Sterile Examination編號/NO：版本號/Version：頁碼/Page起草人： 起草日期： 審核人： 審核日期：批準人： 批準日期：頒發(fā)部門Issued by執(zhí)行日期Effected Date替換文件Replaced for復(fù)審日期Review Date分發(fā)部門Distributed to武漢仝干生物科技Wuhan Togo Biotechnology Co.,Ltd無菌檢測標準操作規(guī)程Standard Operating Procedure of Sterile Examination編號/

2、NO：版本號/Version：頁碼/Page：1、目的建立無菌檢測的基本操作，為無菌檢測人員提供正確的操作規(guī)程。通過無菌檢驗后，確保產(chǎn)品能夠達到無菌的要求。2、適用范圍適用于我公司進行細胞質(zhì)量檢驗的技術(shù)人員。3、內(nèi)容3.1 簡述：無菌檢測系用于檢查細胞是否無菌的一種方法。檢查項目包括需氧菌、厭氧菌及真菌檢查。若供試品符合該項檢查方法的有關(guān)規(guī)定，僅表明在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。3.2 環(huán)境要求：該項檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度萬級背景下的局部百級的單向流區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。其過程必須嚴格遵守無菌操作，日常檢驗需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。人員要求：無菌檢測人員應(yīng)具備微生物及檢驗專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌檢驗培

3、訓。4、無菌檢驗前的準備器具滅菌、消毒試驗過程中與供試品接觸的所有器具必須采用可靠方法滅菌，可置高壓滅菌鍋內(nèi)121蒸汽滅菌30分鐘后使用（根據(jù)滅菌效果驗證決定滅菌參數(shù)）。所有的滅菌物品不應(yīng)超過2周即用畢，否則應(yīng)重新滅菌。凡檢驗中使用的器材無法滅菌處理的，使用前必須經(jīng)消毒處理，如無菌檢驗室的電子天平，工作臺面等，可采用消毒劑浸泡或擦拭。器具的滅菌、消毒后必須做好標識，標明滅菌、消毒時間和使用有效期。人員、物料進入無菌檢驗室開啟紫外燈或臭氧發(fā)生器進行空間滅菌處理，消毒時間不得少于30分鐘。人員進入無菌檢驗室需在一更區(qū)脫去一般區(qū)工作鞋，換無菌檢驗室工作鞋，并在二更區(qū)穿戴無菌服、口罩和手套，口罩掩住口

4、鼻，帽子包裹所有頭發(fā)。進入無菌檢驗室的所有培養(yǎng)基、供試品等需將外包裝在傳遞窗拆除后，查看所有進入無菌檢驗室的器具上的滅菌、消毒標識，是否在有效期內(nèi)，符合要求的于傳遞窗進行表面紫外消毒，傳入無菌檢驗室。5、無菌檢驗室操作要求1）人員進入后，首先進一步消毒擦拭工作臺面。2）全過程必須嚴格執(zhí)行無菌操作，防止微生物污染。3）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放，避免破損，以防培養(yǎng)物擴散。4）所有操作均應(yīng)在近火焰區(qū)進行，且不得有大幅度或快速動作，以免攪動空氣中的塵埃微粒。5）使用金屬接種器具時，用前、用后均需灼燒滅菌。6）在接種培養(yǎng)物時，動作應(yīng)輕、準，防止培養(yǎng)物濺出，產(chǎn)生汽溶膠，造成污染。7）操作過程中所有的帶菌物品

5、，用后均應(yīng)作消毒、滅菌處理?？稍跈z驗過程中隨用隨時放入消毒液缸內(nèi)浸泡或消毒桶內(nèi)，或在檢驗完成后經(jīng)傳遞窗傳至一般區(qū)，立即用壓力蒸汽滅菌鍋121滅菌30分鐘。 6、 培養(yǎng)基制備6.1需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基）的制備所用試劑： 酪胨（胰酶水解） 15.0g 葡萄糖 5.0g L-胱氨酸 0.5g 硫乙醇酸鈉 0.5g （或硫乙醇酸）（）酵母浸出粉 5.0g 氯化鈉 2.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml 瓊脂 0.75g 水 1000ml 制備：除葡萄糖和刃天青溶

6、液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH為。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氧化層的顏色要求：在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否剛需經(jīng)100水浴加熱到粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻，只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。 6.2  霉菌培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基）的制備所用試劑：胨 5.0g 酵母浸出粉 2.0g 葡萄糖 20.0g 磷酸二氫鉀 1.0g 硫酸鎂 0.5g 水 1000 ml 制備：除葡萄糖外，取上述成分混和，微溫溶解

7、，調(diào)節(jié)pH值約為，煮沸，加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH為。還可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基，按照使用說明書配制。培養(yǎng)基配制后應(yīng)盡快滅菌，避免微生物繁殖。一般采用高壓蒸汽121滅菌30分鐘。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在225保存，在3周內(nèi)使用。 6.3 培養(yǎng)基的無菌性檢查每批配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行無菌性檢查（可與產(chǎn)品無菌檢驗同步進行）。檢查時，每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶）培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。7、 稀釋液、沖洗液的制備0.1%蛋白胨水溶液：取蛋白胨，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝后置入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121滅菌30分鐘后，于4保存?zhèn)溆?。氯化鈉-蛋白胨緩沖液： 

8、;取磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、蛋白胨，加水1000ml。微溫溶解，濾清，分裝后置入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121滅菌30分鐘后，于4保存?zhèn)溆?。浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液。 8、對照菌液制備無菌檢驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代。取金黃色葡萄球菌的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，在3035培養(yǎng)1824h后備用，同時制備0.9%氯化鈉溶液加入6支小試管內(nèi)，每支試管內(nèi)加的0.9%氯化鈉溶液，在高壓滅菌鍋內(nèi)經(jīng)121滅菌30分鐘備用。將已配好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液取加入第一支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:10的菌液；取第一支試管內(nèi)l菌液加入第二支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:100的菌液，同法稀釋成濃度1:106（每ml含菌量100CFU）即可。采用平皿計數(shù)法測定活菌數(shù)。9、無菌檢驗培養(yǎng)溫度 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置3035培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基，置2328培養(yǎng)。 10 、無菌檢驗 滅菌前、后菌片應(yīng)按菌片說明書規(guī)定條件保存。10.1 接種開啟單向?qū)恿鳎謩e將滅菌后的菌片成對放入已滅菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，同時以金黃色葡萄球菌作陽性對照，以未接種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和未接種的改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對照。10.2 培養(yǎng)陽性對照管于3035細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)4872小時，其余硫乙