本科生六個基本生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(共8頁)

1、實(shí)驗(yàn)一：感受態(tài)細(xì)胞的制備1.原理：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室獲得了一個新的質(zhì)粒時，而這個質(zhì)粒并未轉(zhuǎn)化到宿主菌體內(nèi)，則需要該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，以大量獲得這一質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方式有很多種，如電轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、CaCl2處理法制備感受態(tài)細(xì)胞等。一般的實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)用CaCl2處理細(xì)菌，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使質(zhì)粒DNA能穿過細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理過的細(xì)菌，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌可在抗菌素培養(yǎng)基上生長形成菌落。這一方法是分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法。2.實(shí)驗(yàn)材料2.1LB液體培養(yǎng)基2.20.1mol/L CaCl2溶液：稱取1.1g無水CaCl2，溶于90ml雙蒸去離子水中，定容至100ml，

2、用0.22m濾器過濾并裝入滅菌試劑瓶中，4保存。2.3 DH5菌株，冰，牙簽，無菌濾紙，50ml離心管，槍頭（以上需滅菌）；移液器，搖床，冷凍離心機(jī)，渦旋震蕩器，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，普通冰箱，-70冰箱3.操作方法3.1從37培養(yǎng)1216h的平板上，用無菌牙簽挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)移到含有3ml LB培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37振搖過夜。次日取菌液1ml，接種到含有100ml LB培養(yǎng)基的500 ml燒瓶中，37劇烈振搖培養(yǎng)約23h（振搖速度為200300r/min），待OD600值達(dá)到0.30.4時，將燒瓶取出立即置冰浴1015min。3.2自該步驟起皆需無菌操作。在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到

3、一個滅菌處理過的、冰預(yù)冷的50 ml離心管中。3.34離心，4000g×5min回收細(xì)胞。3.4棄去培養(yǎng)液，將離心管倒置于濾紙上1min，以使最后殘留的培養(yǎng)液流盡。3.5加入冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重懸菌體，置冰浴30min。3.64離心，4000g×5min,棄去上清液，倒置于濾紙1min。3.7再加4ml用冰預(yù)冷的0.1mol CaCl2重懸菌體（重懸時操作要輕）。3.8置4冰箱置1224h，即可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化。思考題： 制備感受態(tài)細(xì)胞時加入CaCl2的作用是什么？鈣離子結(jié)合于細(xì)胞膜上，使細(xì)胞膜呈現(xiàn)一種液晶態(tài)。在冷熱變化刺激下液晶態(tài)的細(xì)胞膜表面會產(chǎn)生

4、裂隙，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，使外源DNA進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化1. 原理 當(dāng)宿主菌接受CaCl2處理后，細(xì)胞膜通透性改變，感染細(xì)菌的質(zhì)粒很容易地透過細(xì)胞膜，在宿主菌酶系統(tǒng)的作用下，質(zhì)粒大量繁殖。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，可獲得大量的質(zhì)粒DNA，以供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用。一般的實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)用CaCl2處理細(xì)菌。2. 實(shí)驗(yàn)材料2.1，質(zhì)粒GFP-SNAT2-pBK-CMV （kan抗性）2.2，LB固體培養(yǎng)基平板 (kan抗性)，LB液體培養(yǎng)基2.3，感受態(tài)細(xì)胞2.4， 1.5ml離心管，槍頭，三角耙（以上物品需滅菌處理）；移液器，冰，恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，-70冰箱3.操作方法3.1

5、無菌狀態(tài)下取新鮮感受態(tài)50l置于無菌的1.5ml離心管。3.2每管加質(zhì)粒50100ng，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。3.342熱休克90s，不要搖動離心管。3.4每管加無抗生素的普通LB培養(yǎng)基950l，37(150180r/min)搖床，溫和搖振45min。3.5 用無菌彎頭玻璃鋪菌器（三角耙），將10l菌液鋪于含卡那青霉素(Kan)的瓊脂平板表面，37平放20min，然后倒置培養(yǎng)1014h。4.結(jié)果觀察 計(jì)數(shù)全皿菌落數(shù)5.寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告（詳細(xì)描述轉(zhuǎn)化菌落的生長情況）6.思考題請說明每一步驟的原理：冰上30分鐘、42度熱休克90秒、37度溫和震蕩45分鐘等。冰上30分鐘：轉(zhuǎn)化混合物

6、中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面。42度熱休克90秒：42度短暫的熱刺激，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨即出現(xiàn)許多間隙，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。37度溫和震蕩45分鐘：促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得新的表型得到表達(dá)實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的抽提和純化1.原理：質(zhì)粒為多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物染色體的雙鏈環(huán)狀分子。一般情況下，質(zhì)粒并不是它的宿主細(xì)胞所必需的，如細(xì)胞分裂時，分裂的子細(xì)胞中不含質(zhì)粒，但子細(xì)胞仍能生長分裂。然而，許多質(zhì)粒含有在特殊環(huán)境下所必需的抗生素抗性。盡管質(zhì)粒的復(fù)制有賴于宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)進(jìn)行，但質(zhì)粒DNA是獨(dú)立于宿主基因組以外的環(huán)狀分子，對于堿的裂解具有較強(qiáng)的耐受性，

7、因此，用堿裂解法可將質(zhì)粒DNA與宿主的線性DNA分開。2材料2.1質(zhì)粒DNA小抽試劑盒，乙醇2.2含質(zhì)粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV）2.3 離心管，槍頭（以上物品需滅菌）；移液器，離心機(jī)3步驟見試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)四 瓊脂糖凝膠電泳1. 原理：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)。各種生物大分子在一定的pH值條件下，可解離成帶電荷的離子，在電場中向相反的電極移動。分子生物學(xué)領(lǐng)域中，瓊脂糖和聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的凝膠電泳應(yīng)用最多，它們是分離、鑒定和純化DNA及RNA片段的主要方法。該方法操作簡便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度離心法)所無

8、法分離的片段。直接嵌入熒光染料后，在紫外燈下可直接檢出DNA片段所在的位置，如有必要，從凝膠中回收DNA片段，用于各種克隆操作。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠均可制成各種不同大小、形狀和孔徑的凝膠塊，在不同的裝置上進(jìn)行電泳。瓊脂糖比聚丙烯酰胺凝膠的分辨率低，但其分離范圍廣，約200bp50kb的DNA。瓊脂糖凝膠電泳通常在水平裝置上進(jìn)行。聚丙烯酰胺分離小片段(5500bp)的效果較好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。長度大于10 000kb的DNA片段，可以通過電場方向呈周期性變化，在脈沖電場膠中進(jìn)行電泳。2.瓊脂糖凝膠的性質(zhì)：瓊脂糖是從海澡中提取的長鏈狀多聚物，瓊脂糖凝膠點(diǎn)為4045。當(dāng)加熱至9

9、0左右時，即可成清亮、透明的液體，澆在模具上冷卻后固化形成凝膠，瓊脂糖凝膠可區(qū)分相差100bp 的 DNA片段。為了滿足特殊的要求，可選擇低溶點(diǎn)瓊脂糖(<70,低于雙鏈DNA的變性溫度)。3 材料3.1 瓊脂糖，10mg/ml溴化乙錠，1kb DNAmarker3.2 100ml 50×TAE緩沖液：Tris 24.2g,冰乙酸5.71ml，0.5mol/L EDTA(PH6.8) 10ml3.3 6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青FF、30%甘油3.4 槍頭，移液器，錐形瓶，微波爐，制膠槽，梳子，水平電泳儀，穩(wěn)壓器，凝膠成像系統(tǒng)4操作步驟：4.1將

10、膠模槽放于水平工作臺上。4.2用電泳緩沖液在微波爐中將瓊脂糖顆粒用最短的時間完全溶解。熔化瓊脂糖溶液冷卻至60度時，加入濃度為0.5g/ml溴化乙錠10ul，充分混勻。4.3在膠模放置好梳子后，將具有一定溫度的凝膠倒入膠模中，凝膠的厚度在3-5mm之間。注膠時要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。4.4凝膠凝固后通常需要在室溫中放置3045min，小心移去梳子，并將凝膠托盤放入電泳槽?？赏瑫r制作幾塊凝膠，待其固化后用保鮮紙包住以防水分揮發(fā)，置4度保存，通常在數(shù)日之內(nèi)可以使用。4.5加入電泳緩沖液，使液面高出凝膠表面12mm，樣品孔內(nèi)有氣泡，用吸管小心吸去，以免影響加樣。4.6將樣品與上樣緩

11、沖液混合：上樣緩沖液不僅能提高樣品的密度，使樣品均勻沉到孔底，還可使樣品帶色，便于上樣、估計(jì)電泳時間和判斷電泳位置。4.7用微量移液器將樣品依次加在樣品孔內(nèi)。4.8蓋上電泳槽并通電，5V/cm2,恒壓電泳，使DNA向陽極方向移動。4.9電泳完成后切斷電源，取出凝膠。如果凝膠中加有溴化乙錠，可直接在紫外透射燈下觀察，否則就將凝膠浸泡在0.5微克/ml溴化乙錠緩沖液中浸泡3045min。4.10用凝膠分析系統(tǒng)直接觀察并拍照。 5.注意事項(xiàng)：5.1加熱溶解瓊脂糖時應(yīng)不斷地?fù)u動容器，并可對著光線肉眼檢查凝膠溶解情況，使附著在壁上的顆粒完全溶解。5.2在微波爐上加熱時間不要過長，以免引起暴沸。如蒸發(fā)過多

12、的溶液，應(yīng)補(bǔ)充部分緩沖液。5.3氣溫較高或用低熔點(diǎn)、低濃度（小于0.5%）瓊脂糖制膠、倒膠和電泳時，最好在4進(jìn)行。6. 結(jié)果觀察6.1 仔細(xì)觀察DNA泳動的方向。6.2 DNA電泳結(jié)束后，記錄正常組與marker組電泳條帶的相應(yīng)位置。7.書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)五 DNA限制內(nèi)切酶技術(shù)1. 原理：限制性內(nèi)切酶（即限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或內(nèi)切酶）是一類能識別雙鏈分子中特異核酸序列的水解酶，這類酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，促進(jìn)了基因工程和DNA序列測定以及基因診斷技術(shù)的發(fā)展。它的應(yīng)用是當(dāng)代分子生物學(xué)研究最基本、最重要的技術(shù)手段。從質(zhì)粒、噬菌體或粘性質(zhì)粒獲得的含有目的基因重組分子，必須經(jīng)過酶切、電泳分離、回收基因

13、片斷，方可用于重組或探針標(biāo)記。根據(jù)酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反應(yīng)兩種體系。2實(shí)驗(yàn)材料2.1 質(zhì)粒SNAT1-PBK-CMV(600ng/ul，150ul)2.2 限制性內(nèi)切酶EcoRI2.3 1kb DNAmarker2.4 離心管，槍頭，移液器，離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳所需材料3.小量酶切反應(yīng)體系本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定。典型的反應(yīng)是20l體積中含0.21gDNA，酶切反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒DNA 5l10×緩沖液 1l限制酶（根據(jù)質(zhì)粒酶切位點(diǎn)選擇） 1l雙蒸去離子水 3l總體積 10l4.操作方法4.1在一滅菌的新的Ep管中加入3l雙蒸水。4.2加入10

14、×緩沖液1l。4.3加限制酶1l。4.4最后加入質(zhì)粒DNA 5l。4.5稍離心，混合。4.637水浴11.5h。4.7取出后電泳分析鑒定是否酶解。5.注意事項(xiàng)5.1雙蒸水為可變體積，當(dāng)其他反應(yīng)成分的量確定后，用雙蒸水將反應(yīng)體積補(bǔ)足。5.2質(zhì)粒DNA最后加入，以防止操作不當(dāng)引起試劑的污染。5.3為保持限制酶的活性，將酶從低溫冰箱取出后立即置于預(yù)先準(zhǔn)備的碎冰中冰浴，操作應(yīng)迅速，用后立即放回低溫冰箱中。5.4大多數(shù)酶多以濃縮液存放，吸取時需嚴(yán)格取量。若要取用多種酶，每種酶必須單獨(dú)使用吸頭，避免交叉污染。5.5大多數(shù)限制酶均加50%甘油緩沖液置于-20保存，其活力穩(wěn)定，但在配制反應(yīng)混合物時，

15、酶的加入量要準(zhǔn)確限制小于體積的1/10，否則甘油會抑制酶解反應(yīng)。5.6如欲節(jié)省酶的用量，可增加酶解時間，但酶解時間過長，易出現(xiàn)異常條帶。5.7當(dāng)樣品加入反應(yīng)管之后，必須將裝酶試管蓋蓋嚴(yán)，避免溫育時水蒸汽進(jìn)入管內(nèi)。6. 結(jié)果觀察6.1DNA分子中分布的酶切位點(diǎn)的多少與酶解后條帶呈正比。仔細(xì)觀察條帶數(shù)量。6.2. 與Marker 對照，觀察各條帶中的bp數(shù)。6.3. 書寫實(shí)驗(yàn)記錄并畫圖記錄各條帶的位置。實(shí)驗(yàn)六 PCR技術(shù)1. 原理：PCR技術(shù)實(shí)際上是一個在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。整個擴(kuò)增過程分為三步：

16、變性：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；退火：突然降溫后，模板DNA與引物按堿基配對的原則互補(bǔ)結(jié)合。也存在2鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)，主要結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間；延伸：在DNA聚合酶及鎂離子存在時，從引物的3端開始、結(jié)合單核苷酸，形成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。上述三步為一個循環(huán)，理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為下一輪模板鏈循環(huán)的模板， 經(jīng)過25-30個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。2.操作方法針對本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料，體系和條件如下：PCR產(chǎn)物約800bp（一） 材料：2×Taq聚合酶：康為世紀(jì)模板：GFP-SNAT2-pBK-CMV（56ng/ul） 上游引物：12.5uM，35ul（5，-3，CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG） 下游引物：12.5uM，35ul（5，-3，CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG）（二）10ul體系：ddH2O： 2.36ul 2×Taq聚合酶：5ul 上游引物： 0.67ul