天津醫(yī)科大學抗體純化與鑒定技術(shù)-ppt課件

1、抗體純化與鑒定技術(shù)臨床免疫學教研室李會強 教授抗體純化的目的抗體純化的目的去除：雜抗體交叉反響抗體雜蛋白提純IgG及其片段鹽析法粗提丙種球蛋白方法一:實驗原理：實驗原理：蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨鹽的濃度變化而變化。在低鹽濃度下溶解度隨鹽的濃度升高而添加，當鹽濃度到達一定程度時，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。實驗原理：實驗原理：蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團與水構(gòu)成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決議的。當用中性鹽參與蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消逝。實驗原理：實驗原理：同時，中性鹽參與蛋白質(zhì)溶液后，由于離子

2、強度發(fā)生改動，蛋白質(zhì)外表電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。 主要試劑：主要試劑：飽和硫酸銨溶液溫度系數(shù)小，溶解度大767 g/L不同飽和度析出蛋白質(zhì)會依次析出；價錢廉價；不容易引起蛋白量變性；主要試劑：主要試劑：飽和硫酸銨溶液硫酸銨800g850g溶于 1000ml H2O加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28NH4OH調(diào)pH至7.0。0.01Mol/L pH7.4 PB 操作：操作：技術(shù)道路分別血清等倍稀釋50%飽和硫酸銨沉淀留沉淀33%飽和硫酸銨沉淀留沉淀操作：操作：本卷須知硫酸銨的質(zhì)量飽和硫酸銨溶液配制蛋白質(zhì)濃度鹽析過程脫鹽操作：操

3、作：透析除鹽葡萄球菌蛋白A親和層析提取IgG方法二:實驗原理：實驗原理：蛋白A Protein A 或蛋白G Protein G 是細菌胞壁蛋白，它們能結(jié)合抗體Fc段。天然 Protein G具有3個IgG結(jié)合域， 天然的Protein A具有5個IgG結(jié)合域。這一結(jié)合非常結(jié)實，但其親和力對pH的變化敏感，抗體/蛋白A或蛋白G的親和力隨pH的降低而急劇降低。實驗原理：實驗原理：對于哺乳動物IgG,Protein A比Protein G具有更大的親和力,尤其是對于IgG的一些亞類,包括人類的IgG3、小鼠的IgG1即達鼠的IgG2a. 實驗原理：實驗原理：主要試劑：主要試劑：層析載體共價結(jié)合有蛋

4、白A或蛋白G的樹脂 瓊脂糖微球聚丙烯酰胺微球性質(zhì)穩(wěn)定，價錢低廉主要試劑：主要試劑：平衡緩沖液0.01Mol/L pH7.4 PB 洗脫緩沖液檸檬酸緩沖液 pH=3檸檬酸緩沖液 pH=6主要試劑：主要試劑：中和緩沖液氨基丁三醇-氯化鈉 pH=3 pH=6操作：操作：裝柱平衡pH7.4 PBpH3 洗脫緩沖液pH8.9 結(jié)合緩沖液pH6 洗脫緩沖液pH3 洗脫緩沖液操作：操作：留意問題：留意問題：DEAE離子交換層析提取IgG方法三:實驗原理：實驗原理：DEAE-Sephadex A-50陰離子交換樹脂能吸附陽離子；血清中的-球蛋白屬于中性蛋白，其他均屬酸性蛋白。在pH7.27.4的環(huán)境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，-球蛋白不被吸附而得以純化。操作：操作：裝柱平衡pH7.2 PB上樣搜集操作：操作：抗體特異性純化方法四:去除交叉反響抗體，提高免疫血清特異性去除交叉反響抗體，提高免疫血清特異性免疫親和層析是去除交叉反響抗體最有效手段純化抗體的鑒定方法四