分子生物學(xué)緒論7468584239

1、分子生物學(xué)分子生物學(xué)生命科學(xué)領(lǐng)域的革命生命科學(xué)領(lǐng)域的革命oDNA的結(jié)構(gòu)與功能oRNA在蛋白質(zhì)合成中的功能o蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、遺傳密碼的破譯o基因表達(dá)調(diào)控的本質(zhì)被闡明 人類開始了從生物學(xué)的必然王國向自由王國的大進(jìn)軍。分子水平的生物學(xué)研究，正越來越多地影響傳統(tǒng)生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域 分子生物學(xué)的分子生物學(xué)的3條基本原理?xiàng)l基本原理o構(gòu)成生物體各類有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是相同的o生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循共同的規(guī)則o某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性 分子生物學(xué)簡史分子生物學(xué)簡史o理論上的三大發(fā)現(xiàn)理論上的三大發(fā)現(xiàn) 生物的遺傳物質(zhì)是DNA DNA雙螺旋模型 遺傳信息的傳遞

2、方式 o技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn) 基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn) 載體的應(yīng)用 逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) 1.理論上的三大發(fā)現(xiàn)理論上的三大發(fā)現(xiàn) o1.1 生物的遺傳物質(zhì)是生物的遺傳物質(zhì)是DNA oGriffith，1928：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) oAvery，1943：體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) oHershey，1952：噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 英國科學(xué)家格里菲思英國科學(xué)家格里菲思18791941187919411928年，細(xì)菌學(xué)家Griffith肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)無毒的無毒的R型菌與被殺死的有毒的型菌與被殺死的有毒的S型菌混合后轉(zhuǎn)化為有毒的型菌混合后轉(zhuǎn)化為有毒的S型活菌型活菌. 說明說明S菌體內(nèi)有一種菌體內(nèi)有一種轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化

3、因子 Oswald Theodore Avery （ 18771955 ）加拿大生物化學(xué)家艾弗里加拿大生物化學(xué)家艾弗里細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1944年，Avery死去的死去的S型菌并未復(fù)活，而是型菌并未復(fù)活，而是S型菌的型菌的DNA進(jìn)入了進(jìn)入了R型菌，型菌，使其轉(zhuǎn)化為新的使其轉(zhuǎn)化為新的S型致病肺炎雙球菌。型致病肺炎雙球菌。Alfred Day Hershey（19081997）美國微生物學(xué)家赫爾希美國微生物學(xué)家赫爾希噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) o第一步：把宿主細(xì)菌培養(yǎng)在含有35S（或32P）培養(yǎng)基中，然后用T2噬菌體去感染，結(jié)果獲得的子代噬菌體被標(biāo)上35S或32P。o第二步：標(biāo)記了的噬菌體去感染未標(biāo)記

4、的細(xì)菌。1952年，美國Hershey噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) o第三步：強(qiáng)烈攪拌洗滌，以便使吸附在菌體外表的 T2 噬菌體蛋白質(zhì)外殼脫離細(xì)胞并均勻分布，再進(jìn)行離心沉淀，分別測定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。o結(jié)果：幾乎全部 35S都在上清液中，而幾乎全部 32P和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中1952年，美國Hersheyo1.2 DNA雙螺旋模型雙螺旋模型 1953 Watson/Crick 提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型； 意義意義：對生命科學(xué)的發(fā)展作用可與達(dá)爾文學(xué)說媲美，與孟德爾定律齊名。從而使遺傳學(xué)的研究全面進(jìn)入分子遺傳學(xué)階段 oDNA的模型的研究 鮑林研究小組 威爾金斯、富蘭克林研究小組

5、沃生、克里克研究小組鮑林(Pauling)研究小組o主要工作：n鮑林等1951年(提出蛋白質(zhì)-螺旋模型后)開始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。n根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。n提出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。o評價(jià)：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。o注：1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎。威爾金斯、富蘭克林研究小組o主要工作成就：nWilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術(shù)；n于1951年獲得

6、了更為清晰的圖像；n結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)在外側(cè)，同時(shí)測得了DNA螺旋的直徑和螺距。富蘭克林拍攝的DNA晶體的X射線衍射照片，這張照片正是發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵 沃生、克里克研究小組Waston、Crick(1951-1953)：研究手段非常簡單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。理論知識深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。基于已有的研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。（被公認(rèn)為分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志）隨后證明了DNA 半保留復(fù)制的機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題Waston，Cric

7、k和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義oDNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)同時(shí)表明了DNA復(fù)制的明顯方式堿基互補(bǔ)配對原則上的半保留復(fù)制。o提示了基因和多肽成線性對應(yīng)的一個(gè)可能理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基序列；并存在某種遺傳密碼，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。o在其后的幾十年中，科學(xué)家們沿著這兩條途徑前進(jìn)，探明了DNA復(fù)制、遺傳信息表達(dá)與中心法則等內(nèi)容。o1.3 確定了遺傳信息的傳遞方式確定了遺傳信息的傳遞方式n1961 年 Monod 和 Jacob 提出了操縱子學(xué)說；n1964 年 Nirenberg

8、等提出了“三聯(lián)體密碼說”；nCrick 提出了遺傳信息流向和表達(dá)的中心法則o這三大發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了生命科學(xué)的迅速發(fā)展，為基因工程的誕生奠定了重要的理論基礎(chǔ) Gene Expressiono中心法則(central dogma)闡述了生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過程中的信息流向o最初由Crick提出，并經(jīng)過了多次修正2.技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn) o2.1 基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn)基因操作的工具酶的發(fā)現(xiàn)GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶o限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restr

9、iction endonuclease, RE)是是識別識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點(diǎn)或其并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。o分類分類n、n（基因工程技術(shù)中常用型）o作用作用n與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。限制酶命名限制酶命名Hin d 屬屬

10、 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點(diǎn)類酶識別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口 粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口n當(dāng)一個(gè)當(dāng)一個(gè)DNA分子含有分子含有6個(gè)拷個(gè)拷貝的貝的 GAATTC: 它將被酶切成它將被酶切成7個(gè)片段，個(gè)片段，可用凝膠電泳方法將其分離?？捎媚z電泳方法將其分離。(The largest fragment)(

11、The smallest fragment)o采用幾種限制性內(nèi)切酶組合可以使采用幾種限制性內(nèi)切酶組合可以使DNA分子分子產(chǎn)生特定的片段產(chǎn)生特定的片段. ne.g. EcoRI + HindIIIDNA連接酶(DNA ligase )o1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。o活性活性：封閉DNA鏈上缺口，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5-PO4與另一DNA鏈的3-OH生成磷酸二酯鍵。o要求要求：這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。DNA連接酶的作用機(jī)制細(xì)菌的DNA連接酶以NAD為能源，動物細(xì)胞和

12、噬菌體的連接酶以ATP為能源。T4的DNA連接酶可以連接平末端。重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端Klenow片段片段又名又

13、名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基o2.

14、2 基因運(yùn)載工具基因運(yùn)載工具DNA載體的使用載體的使用o染色體外的遺傳因子o細(xì)菌的性因子 F 因子 Lederberg 1946o抗藥性因子（R ） 大腸桿菌素因子（COE） 質(zhì)粒 Cohen 1973基因載體基因載體為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或?yàn)閿y帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(

15、expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。6His噬菌體噬菌體DNADNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gtgt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNAcDNA克?。┛寺。〦MBLEMBL系列（置換型，適用基因組克?。┫盗校ㄖ脫Q型，適用基因組克隆）噬菌體噬菌體( (phage)phage) M13M13噬菌體噬菌體DNADNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng)（含（含lacZlacZ基因）基因）M13mpM13mp系列系列pUCpUC系列系列粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒( (cosmidcosmid)

16、 )酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)(yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)(bacterial artificial chromosome, BAC)動物病毒動物病毒DNADNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他載體其他載體o2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) 逆轉(zhuǎn)錄病毒最早于逆轉(zhuǎn)錄病毒最早于19111911年由年由Rous

17、Rous從雞肉瘤從雞肉瘤組織中分離。組織中分離。 19701970年年BaltimoreBaltimore和和TeminTemin發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制是通過毒顆粒中帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制是通過DNADNA中間階中間階段，病毒段，病毒DNADNA可整合于宿主細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)改變可整合于宿主細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)關(guān)于了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)關(guān)于DNA DNA RNA RNA 蛋白蛋白質(zhì)的概念質(zhì)的概念, ,因而獲得因而獲得NobelNobel PrizePrize。分子生物學(xué)的研究內(nèi)容分子生物學(xué)的研究內(nèi)容 oDNA重組技術(shù)o基因表達(dá)調(diào)控研究 o生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究

18、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)o基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究 DNA重組技術(shù)（又稱基因工程）重組技術(shù)（又稱基因工程）o將不同的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀 oDNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、酶工程及微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)長期深入研究的結(jié)晶，限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶及其它工具酶發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。Cohen等首次進(jìn)行的等首次進(jìn)行的DNA體外重組體外重組PSC101 R6-3： 質(zhì)粒Ner： 抗新霉素基因Sr ： 抗黃胺基因Tcr： 抗四環(huán)素基因r rc cT Tr re eN NS Sr rS Sr r NeNer

19、 rTcTcr rPsc101Psc101R6-3R6-3ECORIECORIECORIECORI轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.coliE.coli連接酶連接酶細(xì)菌基因工程重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交重組重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)

20、操作過程可形象歸納為 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 基因工程是創(chuàng)造奇跡的科學(xué)，有著驚人的發(fā)展?jié)摿蜆O其廣闊的應(yīng)用前景o“我們建議像縫紉一樣，把基因連接到工業(yè)微生物中，促使它們生產(chǎn)大量的生命所需的蛋白質(zhì)這是生物和醫(yī)學(xué)的真正大革命。我們Cetus人員預(yù)言，到2000年，事實(shí)上，所有人類主要疾病都將由雜種微生物生產(chǎn)的對疾病特異的人工蛋白質(zhì)處理而得到治療?！?重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促

21、進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化刺激細(xì)胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療導(dǎo)向治療乙肝疫苗乙肝

22、疫苗(CHO, 酵母酵母)預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂預(yù)防霍亂DNA重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景 o可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等，提高產(chǎn)量、降低成本，使許多有價(jià)值的多肽類物質(zhì)得到廣泛應(yīng)用。o可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，使它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值或功能得以成百上千地提高。如分解石油的工程菌，產(chǎn)生蜘蛛絲的細(xì)菌等。o還可用于基礎(chǔ)研究。無論是對啟動子的研究，還是對轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析，都離不開重組DNA技術(shù)?；虮磉_(dá)調(diào)控研究基因表達(dá)調(diào)控研究o基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個(gè)體生長發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時(shí)序發(fā)生變化，并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正。o基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上。o主要研究方向n信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究n轉(zhuǎn)錄因子研究nRNA剪接研究等。生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究 結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)o一個(gè)生物大分子在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必