太白蓼多糖的硫酸化修飾及其體外抑菌活性分析

1、西 北 農 業(yè) 學 報 ， （ ） ： ： 網(wǎng)絡出版日期： 網(wǎng)絡出版地址： ： 太白蓼多糖的硫酸化修飾及其體外抑菌活性分析收稿日期： 修回日期： 基金項目：陜西省科技攻關項目（ ） ； 陜西省農業(yè)財政項目（ ） ； 西 北 農 林 科 技 大 學 年 “ 大 學 生 創(chuàng) 新創(chuàng)業(yè)訓練計劃” 校重點項目（ ） 。第一作者：安樂 ， 女 ， 碩士研究生， 研究方向為發(fā)育生物學。 ： 通信作者：卿素珠，女，博士，教授，研究方向為基礎獸醫(yī)學。 ： 張為民，男，副教授，研究方向為臨床獸醫(yī)學。 ： 安樂， 趙秋云 ， 覃裴溪 ， 翁茂洋 ， 陳蕾， 柯金鵬 ， 張為民 ， 卿素珠（ 西北農林科技大學動物醫(yī)學

2、院， 陜西楊凌 ）摘要建立并優(yōu)選太白 蓼 多 糖 （ ， ） 硫 酸 化 修 飾 的 條件， 探討硫酸化修飾對太白蓼多糖抑菌活性的影響。以硫酸根取代度為指標， 采用氯磺酸 吡啶法對太白蓼多糖進行修飾， 以氯磺酸 吡啶比 、 反應時間和反應溫 度 為 因 素 水 平 ， 采 用 （） 正 交 試 驗 對 修 飾 條 件 進 行優(yōu)選 。用氯化鋇 明膠濁度法測定修飾產物的硫酸基取代度（ ） ， 傅里葉紅外變幻光譜法測其結構， 微量法測定硫酸化太白蓼多糖（ ， ） 對大腸桿菌和志賀氏菌的最小殺菌濃度。 太 白 蓼 多 糖 硫 酸 化 修 飾 的 最 佳 條 件 為 氯 磺 酸 與 吡 啶 體 積 比

3、為 ， 反 應 溫 度 為 ， 反應時間為， 的硫 酸 基 取 代 度 為 。 紅 外 光 譜 檢 測 到 的 伸 縮 振 動 峰。 和 對大腸桿菌和志賀氏菌均有抑制作用， 它 們 對 志 賀 氏 菌 的 抑 制 作 用 優(yōu) 于 大 腸 桿 菌 。硫 酸 化 修 飾 能 提高太白蓼多糖對大腸桿菌和志賀氏菌的體外抑菌活性。關鍵詞太白蓼多糖； 硫酸化修飾；正交試驗；體外抑菌中圖分類號 文獻標志碼文章編號 （ ） 中藥多糖具有重要的免疫調節(jié)、 抗氧化 、 抗腫瘤、 抗 病 毒 、 抗 癌、 抗 糖 化、 抗 炎 等 免 疫 藥 理 學 作用， 且毒副作用小、 無 殘 留 、 不 產 生 耐 藥 性。

4、 近年來的研究顯示， 中 藥多 糖 經 分 子修飾后其藥理活性有所增強， 而硫 酸 化 修 飾 是 中藥多糖分子修飾方法中應用最廣泛的， 也是最 普遍的一種修飾方法 。 目前 ， 一般采用氯磺酸甲酰胺、 氯磺酸吡啶法 （ 法）、 濃硫酸法、 三氧化硫吡啶法、 三氧化硫三 甲 胺 鹽等 對 中 藥 多糖的支鏈殘基進行硫酯化修飾 。 研究表明， 經硫酸化分子修飾后， 中藥多糖的免疫調節(jié)、 抗病毒 、抗氧化 、 抗腫瘤等生物活性明顯增強。太白蓼 （ ） ，又名大紅粉， 為陜西特有中草藥資源之一， 始載于“ 圖經本草” ， 屬于太白 “ 七藥 ” 之一， 太白蓼的根莖具有清熱解毒、 止血等功效， 民間

5、常用于治療瘧疾腹瀉、吐血、血崩、白帶、外傷出血等病癥。張為民等的 研 究 發(fā) 現(xiàn)， 太 白 蓼 乙 酸 乙 酯 部 位 （ ） 及其分離物 對雞新城疫病毒在雞胚成纖維細胞的增殖具有抑制作用， 并對大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌、 沙門菌 、 多殺性巴氏桿菌和無乳鏈球菌均有一定的體外抑制作用； 進一步研究 證實 ， 太白蓼乙酸乙酯提取物具有明顯的抗腹瀉和抗炎作用， 促進雛雞免疫器官發(fā)育及淋巴細胞的增殖 ， 具有一定的體外抑制大腸埃希菌和沙門氏菌的作用， 并對新城疫病毒在雞胚內增殖具有一定的抑制作用。 體外試驗結果 證實 ， 太白蓼提取物對豬傳染性 胃 腸 炎 病 毒 在 豬 睪 丸 細 胞 （ ）

6、內增殖具有顯 著 的 體 外 抑 制 作 用 。 梁 波 等 的研究表明， 太白蓼揮發(fā)油對所選的大腸桿菌、 傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等 種細菌具有一定的體外抑制作用。 而有關太白蓼多糖的分子修飾及分子修飾 后 藥 理 作 用 等 方 面 的 研 究 尚 未 見 報道 。 本 試 驗 采 用 氯 磺 酸 吡 啶 法 對 太 白 蓼 多 糖（ ，） 進行硫酸化修飾， 正交試驗對修飾條件進行優(yōu)化， 傅立葉 紅 外 光 譜 測 定修飾產物的結構， 并通過體外抑菌試驗 觀 察 硫 酸化太白蓼多糖（ ， ） 對 大 腸 桿 菌 與 志 賀 氏 菌 的 抑制 作 用 ， 為 太 白 蓼 資 源 的 開

7、發(fā) 和 綜 合 利 用 提 供依據(jù) 。材料與方法 材 料 供試中藥太白蓼塊根由陜西省眉縣金渠藥材分公司太白山草藥研究所衛(wèi)拉船中藥師鑒定并提供 。 供試細菌大腸埃希菌（ ） 和志賀氏菌 （ ） 由 西北 農 林 科 技大學獸醫(yī)微生物 實 驗 室 從 患 乳 房 炎 奶 牛 乳 汁 中 分 離 、 鑒 定 并保存 。 主要儀器與試劑試驗用儀器有循環(huán)水多用真空泵、 旋轉蒸發(fā)儀、 自動平衡離心機、 冷凍干燥機 、 紫外分光光度計、 傅立葉紅外光譜儀。所用 藥 劑 有 氯 磺 酸 、 葡 萄 糖 、 明 膠 、 苯 酚 、 吡啶、 乙酸 、 氯化鋇 、 濃鹽酸 、 硫酸鉀 、 三氯乙酸、 無水甲酰胺和氫

8、氧化鈉等均為國產分析純。 方 法 太白蓼多糖的制備太白蓼多糖的提?。?水煎醇沉法） ： 將太白蓼粉碎， 稱取 ， 加蒸餾水煎煮次， 每次煎煮時間為 ， 趁熱用紗布過濾除去藥渣， 合并濾液， 減壓濃縮至 ； 濃縮濾 液 經 離 心 ， 取 上清液 ， 加 入 無 水 乙 醇 ， 使 乙 醇 體 積 分 數(shù) 最 終 達 到 ， 靜置過夜后過濾， 棄去 濾 液 ， 所得沉 淀 物 加熱烘干即得 粗品 。 用下式計算 的得率： 得 率 多 糖 質 量太 白 蓼 樣 品 質 量 多糖濃度的檢測： 得到的 采用苯酚硫酸法 檢測多糖的濃度。 正交試驗優(yōu)化氯磺酸吡啶法制備硫酸化太白蓼多糖硫 酸 化 反 應 各

9、 因 素 水 平 的 確 立根據(jù)文獻 ， 反應溫度、 試劑比例、 反應時間對修飾的影響較大， 因此選取反應溫度（） 、 氯磺酸與吡啶的配比（） 和反應時間（） 為 因素 ， 確立個水平 ， 見表 。 的制備 ： 將帶有攪拌和冷凝裝置的三頸燒瓶置冰鹽浴中， 按照表 設 定的試劑配比加入預冷的無水吡啶 ， 攪拌使之冷卻， 再將氯磺酸 內逐滴加入 ， 共 制 得 種 酯 化 試 劑 。稱取 的 置于 的無水甲酰胺中攪拌均勻， 加入酯化試劑， 按表設定的反應時間和溫度在水浴中攪拌反應 。 反應完成后， 將反應產物加入到 預 冷 的 蒸 餾 水 中 ， 用 質量分數(shù)為 的 調 節(jié)至 ， 用倍體積的無 水

10、 乙 醇 沉 淀 靜 置 。 取 沉 淀 裝 入透析袋 ， 用 自 來 水 透 析 ， 蒸 餾 水 透 析 。透析液經冷凍干燥得 ， 共種 。表 正交試驗篩選制備 的條件 組別 溫度 氯磺酸吡啶 時間 （ ）（）（） （）（） （ ）（） （ ） （ ） 的 鑒 定硫 酸 基 的 定 性 ： 采 用 傅立葉變換紅外光譜法。 硫酸化修飾后結構上具有特殊的和基團 ， 取多糖各， 采用常規(guī) 壓片法 ， 在紅外光譜儀上測定 的紅外光譜， 分析光譜圖。硫的定量 （ 氯化鋇明膠法 ） ：采用氯化鋇明膠濁度法 測 定 樣 品 的 硫 酸 根 含 量 。 硫 酸 基取代度 （ ， ） 是指多糖中每個糖單位上的

11、活性羥基被硫酸根所取代的數(shù)量， 按下式計算： （ ） （ ） ， 其中為硫質量分數(shù)。 和 的 體 外 抑 菌 試 驗瓊脂擴散 法 抑 菌 試 驗 ： 將 和 分 別 配成質量濃度為 的溶液 ， 并以滅菌生理鹽水作為空白對照。 在無菌條件下， 用滅菌 型玻璃棒將各種細菌均勻涂 抹 在 直 徑 為 的瓊脂平板上， 用直徑為 的打孔器打孔， 分別在孔內 加 入 滅 菌 生 理 鹽 水 、 和 ， 于 培養(yǎng) ， 測定不同供試液的抑菌圈直徑 。 重復次， 取平均值 。西 北 農 業(yè) 學 報 卷最 小 殺 菌 質 量 濃 度 （ ， ） 的 測 定 ： 將 和 分別配成質量濃度為 的藥液 。 采用倍稀釋法

12、， 在無菌條件下， 取無菌試管 支（ 規(guī) 格 為 ） ，每 管 加 入 肉 湯， 在第 管中加入藥液， 連續(xù)倍比稀釋到第管， 并從第管棄去。 第、 、 管分別為藥物對照組（ 不加細菌） 、 細菌生長對照組（ 不加藥液） 和肉湯對照組（ 不加細菌和藥物） 。 除第和 管外 ， 其余每管均加入細菌懸液 。接種完成后， 于 培 養(yǎng) ， 重 復次 。吸取各試管培養(yǎng)液各 ， 用滅菌型玻璃棒將細菌均勻涂抹到瓊脂平板上， 于 恒溫培養(yǎng) ， 以菌落數(shù)不超 過個 的 最 低 提 取 物 質量濃度為該提取物的 。結果與分析 太白蓼多糖濃度測定結果用 水 煎 醇 沉 法 提 取 太 白 蓼 ， 所 用 太 白 蓼

13、為 ， 所提取得到的太白蓼多糖為 ， 多糖的得率為 。 在 處測各葡萄糖標準管的吸光度值， 以葡萄糖濃度為橫坐標（） ， 吸光度值為縱坐標（） ， 回歸處理得直線方程為 ， 。 的 溶 液 在 處 的 吸 光 度 值 為 。計算得 的質量分數(shù)為 。 正交試驗結果 硫酸基取代度的測定在紫外可見分光光度計下， 測定各硫酸鉀標準管在 處的吸光度， 以硫酸根質量濃度為橫坐標（） ， 吸光度 為縱坐標（） ， 回 歸 處 理得 直 線 方 程 為 ， 。見圖 。 正交試驗優(yōu)化氯磺酸吡啶法制備硫酸化太白蓼多糖的結果以溫度 、 氯磺酸與吡啶比率、 反應時間為因素進行正交試驗， 結果如表所示 。圖硫酸根質量濃

14、度的標準曲線 表正交試驗篩選制備 的結果 處理編號 溫度 氯磺酸吡啶 時間 硫酸取代度 （ ）（）（） （）（） （ ）（） （ ） （ ） 珡 珡 珡 極差 因素主次順序 優(yōu)水平 優(yōu)組合 期安 樂等 ： 太白蓼多糖的硫酸化修飾及其體外抑菌活性分析由表 可以看出， 各 因 素 的 作 用 表 現(xiàn) 為 ， 即時間對硫酸基取代度影響最大， 其次是反應溫度和酯 化 試 劑 比 率 。 由值 可 知 最 佳 組合為。因此 ， 確定最佳的硫酸酯化工藝條件為 ： 酯 化 試 劑 體 積 比 為 ， 反 應 溫 度 為 ， 反應時間為。 紅外光譜測定結果 和 的傅里葉紅外 光 譜 掃 描 結果見圖和圖。 由

15、 圖 可 知 ， 在 紅 外 光 譜的 處有個的伸縮震動吸收峰 ， 處有 震動吸收峰，證明樣品是多糖； 在 的紅外光譜上， 除了有多糖的吸收特征外， 還有 個特征吸收峰， 個圖 紅外光譜 在 為 不 對 稱 伸 縮 震 動 引 起的 ， 證明硫酸基已經被酯化到太白蓼多糖上。 體外抑菌試驗結果通過瓊脂擴散法可知 和 對大腸桿菌和志賀氏菌均有抑制作用， 和 對志 賀 氏 菌 的 抑 制 作 用 高 于 大 腸 桿 菌 ， 且 對受 試 菌 株 的 抑 制 作 用 高 于 。 最小殺菌質量濃度測定結果如表 和表 所示 ， 由表可知 ， 對志賀氏菌和大 腸 埃 希 菌 的 最 小殺菌質量濃度 分 別

16、為 和 ； 對志賀氏菌 和 大 腸 埃 希 菌 的 最 小 殺 菌 質量濃 度 分 別 為 和 。 表 明 經硫酸化修飾后提高了其抑菌活性。圖 紅外光譜 表 和 對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑（ 珔 ） 組別 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 大腸桿菌 太白蓼多糖 硫酸化太白蓼多糖 滅菌生鹽水 注 ：“” 代表無抑菌圈。 下表同。 ：“” 表 和 對志賀氏菌抑菌環(huán)直徑（ 珔） 組別 志賀氏菌 志賀氏菌 志賀氏菌 志賀氏菌 志賀氏菌 太白蓼多糖 硫酸化太白蓼多糖 滅菌生理鹽水 西 北 農 業(yè) 學 報 卷討 論目前 ， 常用的人工合成硫酸酯

17、多糖的方 法 包括氯磺酸吡啶法 、 濃硫酸法 、 三氧化硫吡啶法等， 其中氯磺酸吡啶法因試劑簡單易得， 反應條件也相對簡單， 取代度較高， 產物回收方便， 成為最常用的方法。 不同 的多糖 ， 因 其分子質量以及多糖分子的空間結構不同， 所以 硫酸化的最優(yōu)條件不 同 ， 最 優(yōu) 條 件 下 的 取 代 度 也 不 同 。 等 用氯磺酸吡啶法制備硫酸化黃芪多糖， 以氯磺酸吡啶配比、 反應溫度和反應時間為因素水平設計正交試驗對黃芪多糖硫酸化修飾條件進行優(yōu)選 ， 發(fā)現(xiàn)最佳條件為氯磺酸 吡啶體積比為 ， 反應溫度 ， 反應時間， 各因素對硫酸基取代度的影響程度依次為反應溫度試劑比例反應時間。 等 采用

18、氯磺酸吡啶法對霍山石斛多糖（ ） 進行了硫酸化修飾， 并以響應面優(yōu)化法探究出條件為 ， ， 氯磺酸吡啶體積比為 時 ， 霍 山 石 斛 多 糖 硫 酸 化 取 代 度 最好， 為 。 等 以 正 交 試 驗 采 用 氯 磺酸 吡啶法對麥冬多糖進行硫酸化修飾， 確定硫酸化最 優(yōu) 條 件 為 氯 磺 酸吡 啶 體 積 比 為， ， 硫 酸 取 代 度 為 。 張 匯 等 采 用氯磺酸 吡啶法對黑靈芝水不溶性多糖進行硫酸化修飾 ， 采用三因素三 水 平 正 交 試驗確定最佳條件為氯磺酸 吡啶體積比為， ， 硫酸取代度為 ， 各因素對硫酸取代度的影響程度為試劑比例溫度反應時間。本試驗采用磺酸吡啶法對太

19、白蓼多糖進行硫酸化修飾， 并用單因素和正交試驗確定條件為酯化試劑體積比為 ， 反應溫度為 ， 反應時間為， 太白蓼多糖硫酸取代度 最 好 ， 為 ， 各 因 素 對 硫 酸 基取代度的影響程度依次為反應時間反應溫度試劑比例 。研究發(fā)現(xiàn)， 多糖的生物活性與多糖的空 間 結構密切相關， 中藥多糖經過分子修飾后， 其空間結構發(fā)生了改變， 產生新的構象， 其物理化學性質、生物活性隨之改變， 可以增強或者賦予中藥多糖更多的 藥 理 活 性 和 減 弱 其 藥 物 毒 性 。 李 公斌 研究表明， 硫酸化黑木耳多糖對金黃色葡糖球菌和大腸桿菌有不同程度的體外抑制作用， 抑制時效可達 。 申進文等 的研究表明

20、，硫酸化秀珍菇發(fā)酵胞外多糖對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌活性。 在一定的質量濃度范圍內， 隨著秀珍菇發(fā)酵胞外多糖硫酸酯質量濃度的增加（ ） ， 其抑制大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的能力迅速增強， 其質量濃度在 時， 對 種細菌的抑制率均達到 左右 。而劉瑩等 的抗菌活性試驗顯示，硫酸化和乙酰化后的金針菇多糖衍生物抗菌活性較弱 ， 對供試的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃 度 為 。 本 試 驗 結 果 表明 ， 硫酸化太白蓼多糖對大腸桿菌和志賀氏菌具有體外抑制作用， 與太白蓼多糖相比， 硫酸化修飾后其抑菌活性明顯增強， 究其原因， 可能是由于磺酸基團 的 加 入

21、， 導 致的 疏 水 性 改 變 ， 對 細菌的細胞膜和細胞壁造成破壞， 引起蛋白質的溶解 和 細 菌 中 的 重 要 分 子 的 滲 透 ， 營 養(yǎng) 物 質 吸 收 、活性及核苷酸合成等功能性障礙， 最終導致細胞死亡。參考文獻 ：劉鋼 ， 葉曉芳， 谷 新 利影 響 中 藥 多 糖 作 用 的 因 素 畜牧獸醫(yī)科技信息， （ ） ： ， ， ， （ ） ： （ ） ， ， ， ， （） ： ， ， ， ， ， （） ： 王新宇， 遲祥 ， 石亮 ， 等 種方法制備 硫 酸 化 小 刺 猴 頭菌多糖吉林農業(yè)大學學報， ， （） ： ， ， ， ， ， （） ： （ ）劉燕瓊，黃雪松硫酸化大蒜多

22、糖的制備及其鑒定食品科學 ， ，（） ： ， ， ，（） ： （ ） ， ， ， ：， ， （） ： 盧可可， 張月巧， 袁婭 ， 等硫酸化修飾多糖抗腫瘤活性構 期安 樂等 ： 太白蓼多糖的硫酸化修飾及其體外抑菌活性分析效關系及分子機制研究 進 展食 品 科 學， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ： （ ）張為民， 張彥明， 邢福珊， 等太白山種中草藥體外抑菌活性部位的篩選 華東 區(qū) 第 十 九 次 中 獸 醫(yī) 科 研 協(xié) 作 與 學術研討會論文集北京：中國農業(yè)出版社， ， ， ， ： ， （ ）張為民， 張彥明， 郭 抗 抗太 白 蓼 提 取 物 體 外 抑 制 新 城 疫 病毒及種細菌的活性部位篩選西北農林科技大學學報（ 自然科學版） ， ， （） ： ， （ ） ， ， （） ： （ ） 張為民，張彥明，卿 素 珠，等太 白 蓼 乙 酸