X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理和文庫(kù)構(gòu)建注意要點(diǎn)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理和文庫(kù)構(gòu)建注意單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理和文庫(kù)構(gòu)建注意要點(diǎn)要點(diǎn)目 錄l 10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介l 10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)要點(diǎn)l 10X單細(xì)胞外出試驗(yàn)流程l 10X單細(xì)胞建庫(kù)流程l 常見問題第1頁(yè)/共11頁(yè)10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序簡(jiǎn)介 10 x Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)核心利用微流控芯片對(duì)細(xì)胞進(jìn)行精確區(qū)分，通過10 x Barcodes標(biāo)記每一個(gè)細(xì)胞，能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從而更高分辨率地揭示細(xì)胞間的細(xì)胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況，在細(xì)胞異質(zhì)性研究中表現(xiàn)出色。 研究領(lǐng)域細(xì)胞異質(zhì)性研究免疫反應(yīng)定點(diǎn)編輯基因的細(xì)胞水平研究發(fā)育及分化新型細(xì)胞發(fā)現(xiàn)

2、構(gòu)建細(xì)胞圖譜 技術(shù)優(yōu)勢(shì)不需要微量擴(kuò)增，降低假陽(yáng)性率靈活的獲取量，可一次性對(duì)500-10000個(gè)細(xì)胞建庫(kù)，提高效率7分鐘之內(nèi)即可完成單細(xì)胞體系制備，捕獲效率高達(dá)65成本低，廣泛的研究應(yīng)用領(lǐng)域，超短的項(xiàng)目周期 細(xì)胞類型生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、其他原代細(xì)胞第2頁(yè)/共11頁(yè)10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)原理10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：是如何實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的分離的？是如何區(qū)分不同的細(xì)胞以及同一細(xì)胞中同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本的呢？微流控技術(shù)Barcoding技術(shù)第3頁(yè)/共11頁(yè)Barcoding技術(shù)第4頁(yè)/共11頁(yè)流式分選組織解離10X單細(xì)胞外出試驗(yàn)流程a/ 細(xì)胞懸液制備（客戶完成）

3、 細(xì)胞懸浮緩沖液：1XPBS with 0.04%BSA 細(xì)胞濃度范圍：700-1200 cells/ul 細(xì)胞活性：80% 血液提取、磁珠純化、流式分選、組織解離等。b/細(xì)胞活性和濃度的測(cè)定 用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞活 性和濃度的計(jì)數(shù)；細(xì)胞懸液不宜在冰上放太久，30分 鐘內(nèi)使用最佳。c/準(zhǔn)備單細(xì)胞Master Mix 提前將試劑拿出化凍備用，在冰上配置Master Mix。d/組裝芯片 手持芯片邊緣將芯片放入芯片架，樣本數(shù)不足8個(gè)， 需要向用不到的通道內(nèi)加入50%甘油，不要向回收 孔中加入50%的甘油 第5頁(yè)/共11頁(yè)f/ 將Master Mix，水和細(xì)胞的混合物，Gel

4、 Beads以及 Partitioning Oil加入芯片中 按-的順序分別添加 樣品和Master Mix、Gel Beads和Partitioning Oil。要盡量減少芯片裝載和運(yùn)行 的間隔時(shí)間。e/ 混合單細(xì)胞懸液、aster ix和水 根據(jù)目標(biāo)捕獲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞濃度確定上樣體積和水 的體積，先向Mix中加入水再加細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液 加入aster ix前用移液器重懸細(xì)胞懸液。不要直接 混合細(xì)胞和水。第6頁(yè)/共11頁(yè)g/運(yùn)行Chromium Controllerh/轉(zhuǎn)移GEMs 槍頭不要緊貼孔的底部，同時(shí)避免產(chǎn)生氣泡， 取出移液器，確保吸頭中沒有氣泡產(chǎn)生i/用回收溶液破裂GEMs第7頁(yè)/

5、共11頁(yè)10X單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建片段化、末端修復(fù)加A尾SPRI磁珠雙端純化接頭連接接頭后純化Index PCRSPRI磁珠雙端純化預(yù)先設(shè)定好PCR儀到4，在冰上準(zhǔn)備片段化反應(yīng)體系。吸液體積要準(zhǔn)確，取上清（去大）和去上清（去小）都不要吸到磁珠，使用新配的80%乙醇，磁珠晾干時(shí)間不超過1min。冰上配置接頭Mix同上一步雙端純化根據(jù)建庫(kù)起始量計(jì)算循環(huán)數(shù)，Index 核對(duì)無誤。第8頁(yè)/共11頁(yè)常見問題Q1:細(xì)胞懸液中雜質(zhì)較多，一方面會(huì)影響計(jì)數(shù)的不準(zhǔn)確，細(xì)胞濃度偏高，細(xì)胞活性偏低； 另一方面會(huì)導(dǎo)致芯片的堵塞。Q2：細(xì)胞直徑較?。?um），不在計(jì)數(shù)儀有效計(jì)數(shù)的大小范圍；細(xì)胞小，染色后容易 被當(dāng)成死細(xì)胞計(jì)數(shù)，導(dǎo)致細(xì)胞活性比實(shí)際的活性低。Q3：GEMs生成