禽病病原之實驗室檢測方法20140425

1、瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！禽病病原之實驗室檢測方法沈元沈元診斷研究診斷研究服務服務中心中心瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！成立成立于于2011年，是年，是集動物疫病集動物疫病診斷、研究和服務為一體的技診斷、研究和服務為一體的技術服務窗口。術服務窗口。 通過檢測服務，對畜禽健通過檢測服務，對畜禽健康水平和疫病狀態(tài)進行全面科康水平和疫病狀態(tài)進行全面科學系統的分析評估，指導養(yǎng)殖學系統的分析評估，指導養(yǎng)殖客戶做好科學防疫和用藥工作客戶做好科學防疫和用藥工作，建立推廣，建立推廣“免疫免疫+用藥用藥+監(jiān)測監(jiān)測+凈化凈化+生物安全管理生物安全管理”的全新

2、方的全新方案式獸醫(yī)服務模式。案式獸醫(yī)服務模式。 瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 與與賓夕法尼亞州立獸醫(yī)診斷中心聯合成立賓夕法尼亞州立獸醫(yī)診斷中心聯合成立“中美動物診中美動物診斷服務中心斷服務中心”，與，與“中國科學院海洋研究所、中國農業(yè)中國科學院海洋研究所、中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所、中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸科學院蘭州獸醫(yī)研究所、中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所、國家生化工程技術研究中心（上海）和國家藥研究所、國家生化工程技術研究中心（上海）和國家獸用生物制品工程技術研究中心等獸用生物制品工程技術研究中心等5 5家單位簽約形成戰(zhàn)略家單位簽約形成戰(zhàn)略合作。實現了技

3、術服務升級；積極探索、實施與規(guī)?；献?。實現了技術服務升級；積極探索、實施與規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)建立養(yǎng)殖企業(yè)建立“戰(zhàn)略合作戰(zhàn)略合作”，實現，實現“產業(yè)鏈共贏產業(yè)鏈共贏”。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普技術服務體系瑞普技術服務體系 四大服務中心四大服務中心 1 1名研究員名研究員 4 4名博士名博士 1515名碩士名碩士 2020名養(yǎng)殖專家名養(yǎng)殖專家 100100多名技術員多名技術員瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 診斷/監(jiān)測聚焦聚焦 研

4、究 服務疾病診斷研究中心疾病診斷研究中心瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！5個業(yè)務室個業(yè)務室1個綜合管理室個綜合管理室 禽病毒檢測室：禽病毒檢測室： 豬病毒檢測室：豬病毒檢測室： 血清學檢測室：血清學檢測室： 細菌學檢測室：細菌學檢測室： 診斷試劑開發(fā)室診斷試劑開發(fā)室：樣品樣品接收與登記接收與登記檢測任務下達檢測任務下達檢測報告的復核與遞送檢測報告的復核與遞送客戶溝通與結果分析客戶溝通與結果分析菌毒種歸檔與保藏菌毒種歸檔與保藏實驗室和物料平衡管理實驗室和物料平衡管理 動物動物疾病疾病診斷研究服務中心診斷研究服務中心疾病診斷研究中心疾病診斷研究中心瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩

5、！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！四大特點四大特點 專業(yè)：人員、場所、專業(yè)：人員、場所、試劑試劑 全面：禽全面：禽1616項；豬項；豬1313項，細菌項，細菌1212項項 規(guī)范：有標準可規(guī)范：有標準可依依 研究：集團化客戶的專題合作研究研究：集團化客戶的專題合作研究瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞

6、普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！先進的儀器設備先進的儀器設備瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！標準的操作程序標準的操作程序瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！定點定人定性定量定期養(yǎng)殖場定性檢測抓住源頭合理定點系統監(jiān)測專人服務專家咨詢固定數量全面監(jiān)測固定周期持續(xù)監(jiān)測五定監(jiān)測機制五定監(jiān)測

7、機制 瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！血清學血清學生化生化組織病組織病理切片理切片藥理學藥理學快速診斷快速診斷基因分析基因分析區(qū)分野毒與疫苗毒區(qū)分野毒與疫苗毒病源分離與鑒定病源分離與鑒定耐藥性分析耐藥性分析抗原性分析抗原性分析環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測毒物分析毒物分析病原鑒定病原鑒定病理變化病理變化確診疾病確診疾病制定方案制定方案監(jiān)測免疫效果監(jiān)測免疫效果野毒感染狀況野毒感染狀況篩選優(yōu)質藥物篩選優(yōu)質藥物分子微分子微生物學生物學微生物微生物學學六六大大監(jiān)測監(jiān)測技術技術瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！七項服務內容七項服務內容瑞普生物，讓您的事業(yè)更

8、精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！4月月9日晚間消息，國內民營預防醫(yī)療服務提供機構愛康國賓日晚間消息，國內民營預防醫(yī)療服務提供機構愛康國賓正式在納斯達克掛牌上市。成為國內首家健康體檢赴美正式在納斯達克掛牌上市。成為國內首家健康體檢赴美IPO上上市企業(yè)。市企業(yè)。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！健康養(yǎng)殖的現狀 食品安全；食品安全； 養(yǎng)殖及生物安全；養(yǎng)殖及生物安全； 疫病的多樣化、復雜化、混合感染等；疫病的多樣化、復雜化、混合感染等； 藥物的嚴格合理使用及殘留；藥物的嚴格合理使用及殘留； 規(guī)模規(guī)模放大的瓶頸；放大的瓶頸；

9、瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！病原的多方面威脅 病毒擴散：禽流感、新城疫己進入全球生態(tài)系統，由于病毒擴散：禽流感、新城疫己進入全球生態(tài)系統，由于防控措施中的某些漏洞，致使病原更廣泛的擴散。防控措施中的某些漏洞，致使病原更廣泛的擴散。 免疫抑制：傳染性免疫抑制：傳染性囊病、馬立克氏病、雞傳染性貧血、囊病、馬立克氏病、雞傳染性貧血、J J亞型淋巴白血病、網狀內皮組織增生癥、呼腸孤病毒病亞型淋巴白血病、網狀內皮組織增生癥、呼腸孤病毒病等的發(fā)生，造成免疫抑制，降低雞體免疫力，更易被細等的發(fā)生，造成免疫抑制，降低雞體免疫力，更易被細菌、支原體感染。菌、支原體感染。 種種代代凈化

10、：種禽凈化：種禽企業(yè)對經胚傳播疾病凈化措施重視不夠企業(yè)對經胚傳播疾病凈化措施重視不夠。必須。必須強化對種雞的沙門菌、支原體、禽白血病、網狀強化對種雞的沙門菌、支原體、禽白血病、網狀內皮組織增生癥病毒、呼腸孤病毒的凈化工作，以保證內皮組織增生癥病毒、呼腸孤病毒的凈化工作，以保證養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！禽病病原檢測內容 確定禽病確定禽病病原，對雞群疫病防控做到病原，對雞群疫病防控做到有的放矢；有的放矢； 監(jiān)測隱性感染，了解雞群健康監(jiān)測隱性感染，了解雞群健康狀況；狀況； 總結疫病流行，為免疫毒株選擇提供參考總結疫病流行，為免疫毒株選

11、擇提供參考數據；數據； 進行疫病凈化，為實現種禽健康養(yǎng)殖提供可行性進行疫病凈化，為實現種禽健康養(yǎng)殖提供可行性方法方法 分離流行毒株，為制備自制抗原和自家疫苗提供分離流行毒株，為制備自制抗原和自家疫苗提供種毒材料種毒材料 基因測序比對，建立養(yǎng)殖集團病毒基因數據庫基因測序比對，建立養(yǎng)殖集團病毒基因數據庫瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！病原檢測流程檢測樣品的接收和初步分析 雞胚法分離病毒 RT-PCR鑒定HA確定血凝性；HI確定ND、AI 初步確定病原 出具PCR檢測報告確定病原種類 出具完整檢測報告 組織 尿囊液 進一步的測序工作瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的

12、事業(yè)更精彩！樣品的采集與運輸瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！正確采樣的重要性瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！以IBV為例 IB根據臨床上病變類型主要分為根據臨床上病變類型主要分為：呼吸道型、腎：呼吸道型、腎型。目前型。目前流行發(fā)病以流行發(fā)病以腎型腎型發(fā)生最為普遍發(fā)生最為普遍。 呼吸道出現呼吸困難呼吸道出現呼吸困難，有，有啰音或喘鳴音啰音或喘鳴音，雛雞感染可引起，雛雞感染可引起死亡。死亡。 青年雞和產蛋雞感染青年雞和產蛋雞感染后可后可引起產蛋雞停產或引起產蛋雞停產或產蛋產蛋下降下降，產產軟殼蛋、沙殼蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。軟殼蛋、沙殼蛋或畸形蛋，

13、蛋清稀薄如水。 病病雞排白色稀糞，脫水雞排白色稀糞，脫水，腎臟腫大，腎臟腫大，花斑腎花斑腎，死亡率，死亡率高。高。 符合上述臨床癥狀之符合上述臨床癥狀之一者可以一者可以懷疑感染雞傳染性支氣管炎懷疑感染雞傳染性支氣管炎病毒，確診需經實驗室檢驗。病毒，確診需經實驗室檢驗。1.臨床診斷瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！采樣工具2.無菌、安全采樣瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV病料采集 急性急性呼吸道型的病雞，應采取呼吸道型的病雞，應采取氣管滲出物氣管滲出物；對于剛撲殺；對于剛撲殺的病雞則采取的

14、病雞則采取支氣管和肺組織支氣管和肺組織。 腎型和腎型和產蛋下降的病雞，應采取病雞的產蛋下降的病雞，應采取病雞的腎臟腎臟和和輸卵管輸卵管。 也也可從可從大腸大腸，尤其是，尤其是盲腸扁桃體盲腸扁桃體或或糞便糞便分離病毒，但分離病毒，但從從消化道分離到的病毒未必與現流行株或發(fā)生的病毒有直消化道分離到的病毒未必與現流行株或發(fā)生的病毒有直接關系接關系。3.適時采樣4.合理、典型采樣瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV病料采集樣品樣品量：要足量，且有備份量量：要足量，且有備份量 血清：血清：至少至少0.5ml 組織：組織：2-3g 棉拭子：旋轉棉拭子：旋轉2-3次，且停留次，且停

15、留3-5s5.適量采樣瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 咽喉咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子時將拭子深入、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮喉頭口及上顎裂來回刮35次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子時將拭子深入次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔并沾取少量泄殖腔并沾取少量糞便。將棉拭子浸入分裝有生理鹽水的離心管，折斷超糞便。將棉拭子浸入分裝有生理鹽水的離心管，折斷超出部分，蓋緊，并送實驗室檢測出部分，蓋緊，并送實驗室檢測。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！組織樣品的保存組織樣品的保存采集采

16、集樣品用封口袋包裝，做好樣品用封口袋包裝，做好標記（編號、棟舍、場名），標記（編號、棟舍、場名），避免產生對檢測的信息干擾。避免產生對檢測的信息干擾。 病毒檢驗樣品病毒檢驗樣品，若若24小時小時內要內要送到實驗室，送到實驗室，可可冰袋冰袋冷藏冷藏處理處理。若。若超過超過24小時小時的應凍結處理的應凍結處理。夏天夏天不建議送檢全雞檢測不建議送檢全雞檢測。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 最終原則就是選擇較厚的泡沫盒，同時多放冰塊。最終原則就是選擇較厚的泡沫盒，同時多放冰塊。病料的包裝瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！病料檢測前處理 將 病 料 放 在

17、 含 有將 病 料 放 在 含 有 1 0 0 0 0 I U / m L 青 霉 素 和青 霉 素 和10mg/mL鏈霉素的鏈霉素的pH值為值為7.4的的PBS內內，置于，置于冰盒內送往實驗室冰盒內送往實驗室。 將病料磨碎，加含抗菌素的將病料磨碎，加含抗菌素的PBS制成制成1:5體積比體積比組織組織懸液懸液，反復凍融，反復凍融，以以3000g離心離心20分鐘，分鐘，取上清液，加入濃度為取上清液，加入濃度為1000IU/mL的青霉素和的青霉素和終濃度為終濃度為1mg/mL的鏈霉素，的鏈霉素，37作用作用1小時后小時后用于用于PCR檢測或雞檢測或雞胚接種胚接種瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物

18、，助您的事業(yè)更精彩！疾病名稱疾病名稱病料采集部位病料采集部位雞新城疫（ND）腦組織、氣管、肺臟、咽喉拭子禽流感（AI）氣管、肺臟、輸卵管、咽喉、泄殖腔拭子雞傳染性支氣管炎（IB）氣管、肺臟、腎臟、咽喉拭子雞傳染性喉氣管炎（AILT）氣管滲出物、氣管、肺禽滑液囊支原體（MS）血液、關節(jié)禽敗血支原體（MG）血液、氣管、肺產蛋下降綜合征（EDS）輸卵管、畸形蛋、變形卵泡包涵體肝炎（IBH）肝臟、腎臟瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！疾病名稱疾病名稱病料采集部位病料采集部位雞馬立克?。∕D）腫瘤組織、毛囊、全血禽白血?。ˋLV）種蛋、胎糞、泄殖腔拭子、腫瘤組織禽腦脊髓炎（AE）發(fā)

19、病雞的腦組織雞病毒性關節(jié)炎（REO）關節(jié)及滲出物、腱鞘傳染性法氏囊?。↖BD）法氏囊、腎臟雞傳染性貧血?。–IA）脾臟、胸腺、法氏囊、骨髓禽網狀內皮組織增殖?。≧E）全血、脾臟、胸腺、法氏囊、腫瘤組織鴨瘟（DP）全血、鼻咽分泌物、糞便、病變組織鴨病毒性肝炎（DVH）全血、肝臟瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！小結 根據雞群發(fā)病日齡、發(fā)病時間、采食情況、根據雞群發(fā)病日齡、發(fā)病時間、采食情況、死淘情況死淘情況、產、產蛋情況、雞舍環(huán)境變化、外界蛋情況、雞舍環(huán)境變化、外界氣候變化等信息氣候變化等信息，再依據，再依據臨床表現、流行病臨床表現、流行病學、大體剖檢病理變化等對雞病做初步

20、診斷學、大體剖檢病理變化等對雞病做初步診斷，采集相應樣品；無法判斷，則需要多部位，采集相應樣品；無法判斷，則需要多部位采集；采集； 保證采集樣本保證采集樣本數量；數量； 無菌處理、方法科學；無菌處理、方法科學； 記錄、保溫、密封；記錄、保溫、密封；瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR檢測技術瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR技術 PCR ：Polymerase chain reaction，即，即聚合酶鏈反應，是通過模擬體內聚合酶鏈反應，是通過模擬體內DNA復制復制的方式，在體外選擇性地將的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊某個特殊區(qū)域擴

21、增出來的技術。區(qū)域擴增出來的技術。 1983，由美國科學家，由美國科學家Kary Mullis首次提出首次提出。 PCR的基本工作原理就是以擬擴增的的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的伸直至完成新的DNA合成。合成。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR原理 PCR反應的基本成分包括反應的基本成分包括5種基本成分：種基本成分：模板模板DNA、特異性

22、引物特異性引物、熱穩(wěn)定、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核聚合酶、脫氧核苷三磷酸（苷三磷酸（dNTPs）、Mg2+。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！2021-12-947瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！以IBV為例 組織樣品的處理組織樣品的處理：肺臟：肺臟或腎臟等組織樣品中加滅菌的或腎臟等組織樣品中加滅菌的0.85%生理鹽水研磨成生理鹽水研磨成5倍倍10倍的懸浮液，反復凍融倍的懸浮液，反復凍融2次次3次后，以次后，以4000g離心離心10min，取上清液作核酸抽提，取上清液作核酸抽提用用。 棉棉拭子

23、的處理：將棉拭子充分捻動擰干后除去拭子，拭子的處理：將棉拭子充分捻動擰干后除去拭子，0.5mL樣品液經樣品液經4000g離心離心10min，取上清液作核酸抽提，取上清液作核酸抽提用用。 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物：取物：取1mL細胞培養(yǎng)物反復凍融細胞培養(yǎng)物反復凍融2次次3次后，次后，以以4000g離心離心10min后取上清液作核酸抽提用。后取上清液作核酸抽提用。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！抽提IBV RNA 取取200uL病料研磨液中病料研磨液中的上清液或尿囊液置于一滅的上清液或尿囊液置于一滅菌菌的的2mL離心管中，同時離心管中，同時設立陰性設立陰性尿囊液或陰性細尿囊液或陰

24、性細胞培養(yǎng)液和傳染性支氣管炎病毒胞培養(yǎng)液和傳染性支氣管炎病毒M41株陽性病毒液株陽性病毒液作為作為陽性對照陽性對照，再分別，再分別加入加入裂解裂解液液1mlTrizol，劇劇烈混合樣品烈混合樣品15s，室溫，室溫放置放置10min。 加入加入200uL三氯甲烷，顛倒離心管三氯甲烷，顛倒離心管混合混合5次，室溫次，室溫靜置靜置10min，4下下10000g離心離心15min。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！抽提IBV RNA 吸取約吸取約500uL上層液上層液至至新的新的無無菌菌離心管中，加入離心管中，加入500uL異丙醇異丙醇/無水乙醇，無水乙醇，顛倒混勻顛倒混勻，4放

25、置放置10min，4下以下以10000g離心離心15min。 小心小心棄去全部上清液棄去全部上清液，加入，加入1mL無無RNase水配置的水配置的75%乙醇溶液，上下輕緩顛倒乙醇溶液，上下輕緩顛倒2次，次，4下以下以7500g離心離心5min。 棄棄去全部上清去全部上清（用移液器吸取或者用吸水紙吸（用移液器吸取或者用吸水紙吸干干），），風干風干510min，即制得，即制得RNA。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！提取RNA時需要注意的問題 經常經常更換新手套和頭套更換新手套和頭套，皮膚上常帶有的汗水、，皮膚上常帶有的汗水、細菌、唾液以及空氣中的灰塵都有大量細菌、唾液以及空

26、氣中的灰塵都有大量RNase。 使用無菌無使用無菌無RNase的塑料的塑料制品避免交叉污染。制品避免交叉污染。 玻璃玻璃器皿可在器皿可在150烘烤烘烤4小時，塑料制品可在小時，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡中浸泡10分鐘，然后用水徹底清分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除洗，高壓滅菌，即可去除RNase。 配制溶液應使用無配制溶液應使用無RNase的水（將水加入處理過的水（將水加入處理過不含不含RNase的玻璃瓶中，加入的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度至終濃度0.01v/v,放置過夜放置過夜,高壓滅菌。注：高壓滅菌。注：DEPC有致有致癌之嫌，需小心操作。癌之嫌，需小心操作。）瑞普

27、生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！RT-PCR反應（40ul體系）組份組份加入體積（加入體積（L）5 M-MLV Buffer4dNTP Mixture3Random Primer1M-MLV反轉錄酶0.4RNase inhibitor0.4RNA10-24RNase-free water補至40程序：程序：30 10 min；42 1 h；72 15 min；冷卻冷卻至至4；-20保存。保存。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 設立設立以以IBV M41株的株的cDNA為模板的陽性為模板的陽性IBV 病病毒對照和陰性尿囊液或陰性細胞培養(yǎng)物的毒對照和陰性

28、尿囊液或陰性細胞培養(yǎng)物的cDNA為模板的陰性對照為模板的陰性對照。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR材料與程序瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR的反應體系組份組份加入體積（加入體積（L）ddH2O13.210 PCR Buffer2.0dNTP Mixture1.6Primer.F0.5Primer.R0.5rTaq DNA酶酶0.2cDNA模板模板2.0Total2095預變性5 min；94 40 s；53 40s；72 50共30個循環(huán)；72延伸10min，4終止反應。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR檢

29、測中的常見問題 RNARNA酶的污染酶的污染 內源的內源的RNARNA酶：進行組織裂解酶：進行組織裂解時加入時加入RNARNA酶抑制劑酶抑制劑 外部環(huán)境的外部環(huán)境的RNARNA酶：酶：帶一次性帶一次性手套和口罩，所有試劑和儀器手套和口罩，所有試劑和儀器都必須經過消毒處理和都必須經過消毒處理和RNARNA酶酶抑制劑處理抑制劑處理 EBEB的的問題，替代物問題，替代物GoldviewGoldview或或Gel-redGel-red瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR產物的凝膠電泳和回收 PCR產物經過產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳，的瓊脂糖凝膠電泳，100V，45min 將

30、電泳結束的膠板置于紫外拍攝儀中觀察將電泳結束的膠板置于紫外拍攝儀中觀察PCR結果結果 將目的條帶用刀片切下，用凝膠回收試劑盒進行回收將目的條帶用刀片切下，用凝膠回收試劑盒進行回收 回收的目的條帶直接送測序公司測序回收的目的條帶直接送測序公司測序瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV凝膠成像瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR檢測中的常見問題結果出現假陽性結果出現假陽性 目標序列太短或者引物序列太短，導致出現假陽性；需目標序列太短或者引物序列太短，導致出現假陽性；需要重新設計引物要重新設計引物 靶序列或擴增產物交叉污染；加樣時要小心，陽性對照靶序

31、列或擴增產物交叉污染；加樣時要小心，陽性對照應最后加或者通過巢氏應最后加或者通過巢氏PCR進行擴增能顯著提高擴增的進行擴增能顯著提高擴增的特異性特異性 條帶出現但是與目標條帶大小不一致；引物聚合形成的條帶出現但是與目標條帶大小不一致；引物聚合形成的引物二聚體，退火時引物二聚體，退火時Mg2+離子濃度過高或者退火溫度偏離子濃度過高或者退火溫度偏低低瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR檢測中的常見問題結果出現假陰性結果出現假陰性 PCR產物放置時間過長；產物放置時間過長；PCR產物最好當日上電泳，不產物最好當日上電泳，不要超過要超過48h，超過，超過48h再上樣條帶可能不

32、規(guī)則甚至消失。再上樣條帶可能不規(guī)則甚至消失。 Mg2+濃度過高或過低；濃度過高或過低；Mg2+濃度過高可降低濃度過高可降低PCR擴增擴增的特的特 異性，濃度過低則影響異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使擴增產量甚至使PCR擴擴增失敗而不出現擴增條帶。增失敗而不出現擴增條帶。 反應體系的突然改變；通常進行反應體系的突然改變；通常進行PCR擴增采用的體積為擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul，在放大體系時，一定要模索條件，在放大體系時，一定要模索條件，否則容易失敗。否則容易失敗。 退火溫度過低；可緩慢提高退火溫度退火溫度過低；可緩慢提高退火溫度瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您

33、的事業(yè)更精彩！PCR檢測中的常見問題PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶 其原因往往由于凝膠濃度或者沒有充分凝固，酶其原因往往由于凝膠濃度或者沒有充分凝固，酶量過多或酶的質量差，量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，濃度過高，Mg2+濃濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數過多度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數過多引起。引起。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV結果判定 陽性對照在約陽性對照在約740bp和和290bp處分別有一條特異性處分別有一條特異性的的DNA條帶，陰性對照則無相應的特異性條帶出條帶，陰性對照則無相應的特異性條帶出現

34、，則實驗成立?，F，則實驗成立。 待待檢樣品在相應的位置如出現特異性條帶，或者僅檢樣品在相應的位置如出現特異性條帶，或者僅在約在約740bp出現條帶或者僅在月出現條帶或者僅在月290bp處出現特異處出現特異性條帶，則均可判為性條帶，則均可判為陽性。陽性。 如果需要進一步驗證的話，可以將獲得的大小約為如果需要進一步驗證的話，可以將獲得的大小約為740bp或或290bp的的PCR產物回收純化后測序，將測產物回收純化后測序，將測序結果提交美國國家生物技術中心（序結果提交美國國家生物技術中心（NCBI）進行）進行BLAST分析。分析。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV測序結果

35、分析 IBV S1基因進化分析表基因進化分析表明，分離株明，分離株SD140120-1與流行毒株與流行毒株A2、LX4等均屬于基因型等均屬于基因型LX4，但不在同一亞分支，而但不在同一亞分支，而與與 H B 1 4 0 1 1 6 B 、JS101024等處于同一亞等處于同一亞分支，與常規(guī) 疫苗株分支，與常規(guī) 疫苗株H120等不屬于同一基因等不屬于同一基因型型。NDV、AIV檢測結果的不同分析檢測結果的不同分析瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！其他病原疫病名稱疫病名稱核酸類型核酸類型雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞病毒性關節(jié)炎、禽呼腸孤、傳染性法氏囊、禽白血病、鴨黃

36、病毒RNA雞傳染性貧血病、雞傳染性喉氣管炎、馬立克氏病、網狀內皮組織增生病、包涵體肝炎、鴨瘟病毒、鴨細小病毒DNA瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！DNA抽提方法 180l樣品樣品+1mlDNAiso，顛倒混勻，靜置，顛倒混勻，靜置5min RT，4 10000g離心，離心，10min； 取上清取上清移移至新離心管中，加至新離心管中，加500l無水乙醇，反復顛無水乙醇，反復顛倒直至出現云霧狀倒直至出現云霧狀DNA沉淀，沉淀，4000g離心離心 5min； 棄上清，加棄上清，加1ml 75%乙醇（切勿觸及沉淀），輕緩乙醇（切勿觸及沉淀），輕緩上下顛倒洗滌，上下顛倒洗滌，4

37、12000g離心離心，5min；然后再次；然后再次洗滌；洗滌； 棄上清，室溫短時干燥；棄上清，室溫短時干燥； 加加3060 l TE/ddH2O溶解，溶解，-20保存。保存。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普診斷中心PCR檢測核酸的優(yōu)勢技術 NDV疫苗毒和流行毒株疫苗毒和流行毒株M： 1kbMarker1#：NDV基因基因II型病毒型病毒2#：NDV基因基因VII型病毒型病毒N： 陰性陰性對照對照P： NDV分離毒陽性對照分離毒陽性對照瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！瑞普診斷中心PCR檢測核酸的優(yōu)勢技術 PCR區(qū)分區(qū)分IBV的疫苗的疫苗毒株和毒

38、株和流行流行毒株毒株M:1kbMarker1#: H120株株2#：4/91毒株毒株N：陰性陰性對照對照P：IBV分離毒分離毒陽性對照，陽性對照，4/91血清型血清型瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！PCR檢測核酸的優(yōu)點及局限性優(yōu)點優(yōu)點必須有一個龐大必須有一個龐大 的已知序列的的已知序列的 數據庫。數據庫。 特異特異 敏感敏感 快速、快速、 簡便簡便 易自動化等易自動化等檢測陰性并不能檢測陰性并不能 完全判定陰性完全判定陰性PCR的結果的結果 并不總是可靠并不總是可靠局限性局限性瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！DNA病毒病毒RNA病毒病毒組織病組織

39、病料或者料或者雞胚尿雞胚尿囊液囊液RTPCR凝膠電泳凝膠電泳圖譜觀察分析圖譜觀察分析測序分析測序分析小結 步步防止污染；步步防止污染； 設置陰陽性對照；設置陰陽性對照；瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV、NDV、AIV-H9流行變化趨勢01020304050602013.12013.22013.32013.42013.52013.62013.72013.82013.92013.102013.112013.122014.12014.22014.3陽性數陽性數IBVNDVAIV-H9瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！核酸檢測的后續(xù)分析瑞普生物，讓您

40、的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！禽原病毒分離瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！實驗室常用的病毒分離方法 接種接種易感動物易感動物 接種接種SPF雞胚雞胚 接種接種敏感敏感細胞，常用細胞如細胞，常用細胞如DF-1、CEF、Marc-145等。等。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！雞胚接種法檢測病原 主要主要分離毒種：分離毒種：NDV、AIV-H9、AIV-H5、IBV、IBDV、IBHV、ILTV、REOV等。等。 主要接種方式：尿囊腔接種、絨毛尿囊膜主要接種方式：尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、卵黃囊接種等。接種、卵黃囊接種等。 根據不同毒種對

41、雞胚不同部位的敏感性進根據不同毒種對雞胚不同部位的敏感性進行接胚。行接胚。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！病料接種雞胚的原則 一般一般嗜神經性病毒主要動物腦內接種；嗜神經性病毒主要動物腦內接種； 嗜嗜呼吸道病毒接種動物鼻腔及雞胚尿囊腔；呼吸道病毒接種動物鼻腔及雞胚尿囊腔； 嗜嗜皮膚性病毒接種動物皮內、皮下或雞胚絨毛尿皮膚性病毒接種動物皮內、皮下或雞胚絨毛尿囊膜；囊膜； 嗜嗜內臟病毒可接種動物的腹腔、靜脈、肌肉等。內臟病毒可接種動物的腹腔、靜脈、肌肉等。 近年來，由于組織培養(yǎng)技術的廣泛應用，多數病近年來，由于組織培養(yǎng)技術的廣泛應用，多數病毒都能夠用組織培養(yǎng)進行分離鑒定。毒

42、都能夠用組織培養(yǎng)進行分離鑒定。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！病毒病毒適宜接種適宜接種部位部位接種胚接種胚齡齡收獲材料收獲材料NDV, AIV, IBV尿囊腔9-11尿囊液IBDV, REOV, ILTV, FPV絨毛尿囊膜9-11絨毛尿囊膜及胚體研磨液IBHV，CIAV，ALV卵黃囊5-8胚體研磨液瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！照胚照胚病料處理病料處理接種雞胚接種雞胚培養(yǎng)照胚培養(yǎng)照胚收胚收胚HA/HIPCR出具檢測結果出具檢測結果瑞普生物，讓您的事業(yè)更精

43、彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！ 用用SPF雞胚雞胚，至少使用白殼非免胚。，至少使用白殼非免胚。 孵化時一般選擇相對濕度為孵化時一般選擇相對濕度為60%，最低溫，最低溫度度36，一般，一般37.5。每日翻蛋最少。每日翻蛋最少3次，次，大頭朝上，注意雞胚位置大頭朝上，注意雞胚位置 孵化孵化3-4天照蛋時，如果雞胚天照蛋時，如果雞胚正?？梢娗逦？梢娗逦牡难芗疤?，血管及胎動，血管分支血管分支明顯；去除死胚明顯；去除死胚、無精胚。、無精胚。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！雞胚的選擇正常雞胚正常雞胚無精蛋無精蛋死胚死胚裂紋胚裂紋胚瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助

44、您的事業(yè)更精彩！IBV病料的處理和接種準備 取病料上清液，加抗生素取病料上清液，加抗生素（1000IU/mL青霉素和青霉素和1mg/mL的鏈霉素）置的鏈霉素）置37水浴水浴30min或置于或置于4過夜，然后過夜，然后12000rpm離心取離心取上清液，或者上清液，或者用用0.22m的無菌的無菌濾膜過濾除菌濾膜過濾除菌。 照照蛋用鉛筆畫出氣室和胚胎的蛋用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置。位置。 用碘酊在接種處的蛋殼上用碘酊在接種處的蛋殼上消毒并消碘，消毒并消碘，并在該處并在該處打孔。打孔。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV雞胚接種方式 接種接種于于5枚枚9日齡日齡-11日齡日

45、齡SPF雞胚尿囊腔內，另雞胚尿囊腔內，另取取5枚接種枚接種PBS液，接種量均為液，接種量均為0.2mL/枚枚。37孵育。每天照蛋，孵育。每天照蛋，24小時內死亡的雞胚棄去小時內死亡的雞胚棄去。收。收集接種后集接種后3d-7d的雞胚尿囊液，將所有尿液液混的雞胚尿囊液，將所有尿液液混合，用含合，用含1000IU/mL青霉素和青霉素和1mg/mL的鏈霉素的鏈霉素的的PBS液稀釋液稀釋510倍，繼續(xù)在雞胚內傳代。典倍，繼續(xù)在雞胚內傳代。典型的野毒株通常在雞胚中傳至第型的野毒株通常在雞胚中傳至第2代或低代或低3代，可代，可見侏儒胚，傳至第三代，某些雞胚可出現死亡。見侏儒胚，傳至第三代，某些雞胚可出現死亡

46、。含毒尿囊液置含毒尿囊液置-60以下可長期保存，也可凍干以下可長期保存，也可凍干保存保存4保存保存。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV雞胚接種方式 將分離物經雞胚傳至將分離物經雞胚傳至3代或代或3代以上，收獲代以上，收獲接種后接種后7d（168h）仍存活的雞胚，取胎兒）仍存活的雞胚，取胎兒，用剪刀剪除胎兒體外的附屬物，并用吸，用剪刀剪除胎兒體外的附屬物，并用吸水紙水紙吸干吸干胎兒表面的液體。如果接種胎兒胎兒表面的液體。如果接種胎兒重量比對照雞胚胎兒重量重量比對照雞胚胎兒重量少少2g以上者，可以上者，可初步判定為有病毒感染。初步判定為有病毒感染。瑞普生物，讓您的事業(yè)更

47、精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！IBV接胚結果 雞胚呈蜷縮狀，雞胚外層包裹一層絨膜，雞胚呈蜷縮狀，雞胚外層包裹一層絨膜，發(fā)育不全，侏儒胚發(fā)育不全，侏儒胚。瑞普生物，讓您的事業(yè)更精彩！瑞普生物，助您的事業(yè)更精彩！絨尿膜接種-人工氣室法 取取10-11日齡雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育狀日齡雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育狀況，劃出氣室位置，將絨尿膜發(fā)育區(qū)做一記號。況，劃出氣室位置，將絨尿膜發(fā)育區(qū)做一記號。 將雞將雞胚橫臥胚橫臥于蛋座上，絨尿膜區(qū)朝上。于蛋座上，絨尿膜區(qū)朝上。 用碘酒消毒絨尿膜區(qū)及氣室中心部，在氣室中心用碘酒消毒絨尿膜區(qū)及氣室中心部，在氣室中心部錐小孔。然后用錐子在記號處錐一約部錐小孔。然后用錐子在記號處錐一約0.5mm深深小孔，使卵殼穿孔，而殼膜不破。小孔，使卵殼穿孔，而殼膜不破。 用吸耳球吸