布病血清學(xué)檢疫定稿

1、布病血清學(xué)檢疫定稿 1887年英國(guó)軍醫(yī)Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國(guó)士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。 布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。 布魯氏菌病簡(jiǎn)稱布病。 布魯氏菌簡(jiǎn)稱為布氏菌布魯氏菌病布魯氏菌病 適用范圍適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物布魯氏菌病的診斷技術(shù)。 本規(guī)定的虎紅平板凝集試驗(yàn)、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)適用于家畜布病田間篩選試驗(yàn)和乳牛場(chǎng)布病的監(jiān)測(cè)及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗(yàn)；試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試管凝集試驗(yàn)不適用于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜

2、的檢疫。布魯氏菌病檢驗(yàn)方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌病檢驗(yàn)方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2002 布氏桿菌分離培養(yǎng)布氏桿菌分離培養(yǎng) 布菌培養(yǎng)：瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)。 布菌鑒定：菌落形態(tài)觀察、涂片、染色、鏡檢布氏菌，診斷血清凝集試驗(yàn)。試管增菌試管增菌圖2血平皿 布氏菌菌落圖1瓊脂布魯氏菌菌落布氏菌革蘭染色鏡檢布氏菌革蘭染色鏡檢 布病布病血清學(xué)血清學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)12布病虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)布病虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)布病試管凝集實(shí)驗(yàn)布病試管凝集實(shí)驗(yàn)布病虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)布病虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn) 材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備： 抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由青島易邦生物科技公司提供，按說明用。 受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白

3、凝塊，無溶血和無腐敗氣味。 準(zhǔn)備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個(gè)4厘米小格或虎紅平板凝集試驗(yàn)玻璃板、陶瓷板。 用移液器，適于滴加0.03ml（即300l）液體。 原理：原理： 利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性，主要檢查血清中的IgG類抗體。操作方法操作方法 在實(shí)驗(yàn)薄片上標(biāo)記好位置滴加0.03ml的抗原。圖1. 在每一個(gè)標(biāo)記好的布病抗原上滴加0.03ml的待檢血清，用移液器吸頭攪混均勻。 每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性、陽性血清對(duì)照?qǐng)D圖1 1 判定結(jié)果前最好將抗原與血清混合物搖動(dòng)幾下.如圖3. 在陰性、陽性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。 被檢血清在4分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉

4、眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（）。 每份被檢血清在規(guī)定時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)凝集反應(yīng)者判為陽性，不出現(xiàn)凝集為陰性反應(yīng)。結(jié)果判定結(jié)果判定注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 本抗原適合于大數(shù)量田間檢疫和篩選診斷試驗(yàn)用。 本試驗(yàn)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動(dòng)物，需經(jīng)試管凝集試驗(yàn)或其它輔助試驗(yàn)方可定性。 本抗原使用前應(yīng)充分搖勻，方可使用。 凡本抗原出現(xiàn)污染或搖不散的凝集塊者不得使用。布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn) 原理：布氏菌侵入機(jī)體后，就會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，就會(huì)形成肉眼可見的凝集反應(yīng)，也就是用已知抗原查未知抗體。 稀釋液：

5、0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗(yàn)羊血清時(shí)用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液。 1.2抗原、陽性血清、陰性血清由指標(biāo)單位提供，按說明書使用。 1.3 凝集試驗(yàn)管（三分管）、試管架、吸管及溫箱等。 三分是英制管道直徑長(zhǎng)度的叫法，換算成毫米為三分是英制管道直徑長(zhǎng)度的叫法，換算成毫米為9.525mm，這里指內(nèi)徑約為，這里指內(nèi)徑約為10mm試管試管材料準(zhǔn)備 1.按常規(guī)方法采血分離血清。 2.運(yùn)送和保存血清樣品時(shí)防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價(jià)。若3d內(nèi)不能送檢，按每9ml血清加1ml5%石碳酸生理鹽水防腐，也可冷藏方法運(yùn)

6、送血清。 3.被檢血清的稀釋 以羊和豬為例，每份血清用4支凝集試管。 3.1 第1管標(biāo)記檢驗(yàn)編碼后加1.15mL稀釋液。 3.2 第24管各加入0.5mL稀釋液。 3.3 然后向第1管內(nèi)加入0.1mL被檢血清，并混合均勻。充分混勻后棄去混合液0.25mL。操作方法 3.4 取0.5ml混合液加入第2管，混合均勻。 3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。 3.6 稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50和1:100。 3.7 牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1管加1.2mL稀釋液和0.0

7、5mL被檢血清。 3.8 將0.5mL稀釋好（具體稀釋倍數(shù)參照試劑生產(chǎn)廠家的要求，一般是1：20）的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25、1:50、1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、1:200和1:400。 大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用2個(gè)稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝?dòng)?：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。 1號(hào)管2 號(hào)管 3號(hào)管 4號(hào)管. n0.5%石炭酸10%鹽水1.150.50.50.5.最后一最后一管棄去管棄去0.5ml 被檢血清或陽陰性血清對(duì)照加加0.1ml血清，血清，混勻后棄去混勻后

8、棄去0.25ml最后最后體積為體積為1ml0.50.50.5. 試 管 中 加抗原以前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液加抗原液（1：10稀稀釋好的釋好的） 0.50.50.50.50.50.5血清稀血清稀釋度釋度1:251:501:1001:200.充分混勻充分混勻3718-2418-24小時(shí)溫育小時(shí)溫育 結(jié)果判定 +-吸0.5ml 12 3 4. n0.5%石炭酸鹽水1.20.50.50.5.最后一管最后一管棄去棄去0.5ml 被 檢 血 清或 陽 陰 性血清對(duì)照加加0.05ml血清，混血清，混勻后棄去勻后棄去0.25ml最最后體積為后體積為1ml0.50.50.5.試 管

9、 中 加抗 原 以 前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液加抗原液（1：10稀稀釋好的釋好的） 0.50.50.50.50.50.5血清稀血清稀釋度釋度1:501:1001:2001:400.充分混勻充分混勻3718-2418-24小時(shí)溫育小時(shí)溫育 結(jié)果判定 +-吸0.5ml比濁管的制備 + + + +生理鹽水（ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00稀釋抗原（ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.001.000.750.500.250.250.500.751.001.001.001.001.0051234 3.9 每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和

10、抗原對(duì)照， a)陰性血清對(duì)照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與被檢血清相同。 b)陽性血清對(duì)照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與被檢血清相同。 c)抗原對(duì)照：稀釋好的抗原液0.5ml,再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。 3.10 將稀釋好各管置3740溫箱24小時(shí)，取出檢查并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn) 1供判定參照比濁管制備方法略 2 結(jié)果判定 2.1凝集成度分為： 參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀 菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮； 菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮； 菌體凝集顯著，液體50%清亮； 凝集物有沉淀，液體25%清亮； 凝集物無沉淀，液體均勻混濁。 2.2牛、馬、鹿、駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現(xiàn)“”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，被檢血清判定為陽性。 2.3牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋，出現(xiàn)“”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，被檢血清判定為可疑反應(yīng)。 可疑反應(yīng)家畜經(jīng)34周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場(chǎng)的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)