論文資料-上海市腹瀉病監(jiān)測技術(shù)方案2（word）可編輯

1、.袈肂薄襖羀芇蒀襖膂肀蒆袃袂莆莂袂羄腿蝕袁肇莄薆袀腿膇蒂罿衿莂莈薆羈膅芄薅肅莁薃薄袃膃蕿薃羅葿蒅薂肈節(jié)莁薂膀肄蝕薁袀芀薅薀羂肅蒁蠆肄羋莇蚈螄肁芃蚇羆芇螞蚆肈腿薈蚆膁蒞蒄蚅袀膈莀蚄羃莃芆蚃肅膆薅螂螅莁蒁螁袇膄莇螀聿莀莃螀膂芃蟻蝿袁肅薇螈羄芁蒃螇肆肄荿袆螆艿芅裊袈肂薄襖羀芇蒀襖膂肀蒆袃袂莆莂袂羄腿蝕袁肇莄薆袀腿膇蒂罿衿莂莈薆羈膅芄薅肅莁薃薄袃膃蕿薃羅葿蒅薂肈節(jié)莁薂膀肄蝕薁袀芀薅薀羂肅蒁蠆肄羋莇蚈螄肁芃蚇羆芇螞蚆肈腿薈蚆膁蒞蒄蚅袀膈莀蚄羃莃芆蚃肅膆薅螂螅莁蒁螁袇膄莇螀聿莀莃螀膂芃蟻蝿袁肅薇螈羄芁蒃螇肆肄荿袆螆艿芅裊袈肂薄襖羀芇蒀襖膂肀蒆袃袂莆莂袂羄腿蝕袁肇莄薆袀腿膇蒂罿衿莂莈薆羈膅芄薅肅莁薃薄袃膃蕿

2、薃羅葿蒅薂肈節(jié)莁薂膀肄蝕薁袀芀薅薀羂肅蒁蠆肄羋莇蚈螄肁芃蚇羆芇螞蚆肈腿薈蚆膁蒞蒄蚅袀膈莀蚄羃莃芆蚃肅膆薅螂螅莁蒁螁袇膄莇螀聿莀莃螀膂芃蟻蝿袁肅薇螈羄芁蒃螇肆肄荿袆螆艿芅裊袈肂薄襖羀芇蒀襖膂肀蒆袃袂莆莂袂羄腿蝕袁肇莄薆袀腿膇蒂罿衿莂莈薆羈膅芄薅肅莁薃薄袃膃蕿薃羅葿蒅薂肈節(jié)莁薂膀肄蝕薁袀芀薅薀羂肅蒁蠆肄羋莇蚈螄肁芃蚇羆芇螞蚆肈腿薈蚆膁蒞蒄蚅袀膈莀蚄羃莃芆蚃肅膆薅螂螅莁蒁螁袇膄莇螀聿莀莃螀膂芃蟻蝿袁肅薇 上海市腹瀉病監(jiān)測的實驗室檢測標準操作程序第一部 細菌學檢測的技術(shù)方案一）霍亂弧菌檢測操作程序1.標本檢測流程圖：糞便或肛拭子可選：APW增菌液36±1 2次增菌6h-8h36±1

3、 18-24h雙洗平板 TCBS平板弧菌顯色平板36±1 18-24hAPW增菌液36±1增菌6h-8h挑取可疑菌落5-10個，用霍亂弧菌O1/O139多價診斷血清進行玻片凝集O1群（小川和稻葉）及O139群霍亂弧菌的O1，O139菌體抗原及CTX基因的PCR檢測上報市疾控進一步鑒定. 2. 操作步驟：2.1 增菌：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），放入堿性蛋白胨水（APW）培養(yǎng)基中36±1增菌6-8h。2.2分離及二次增菌：增菌后從菌液生長最茂盛的菌膜下表層，取一接種環(huán)，劃線接種于雙洗平板，TCBS或弧菌顯色平板。37培養(yǎng)1824h后，選擇單菌落做血清凝集實

4、驗。標本含菌量少時，為提高檢出率，實行2次增菌，取第1次堿胨水增菌6h8h的培養(yǎng)物的表層液0.1mL0.2mL，接種于8mL10mL的堿胨水中，37培養(yǎng)6h8h再做分離。2.3血清學鑒定：從平板上挑取可疑菌落5-10個。雙洗平板上為濕潤、黑芯、光滑菌落。TCBS上為黃色發(fā)亮、表面光滑、稍凸起的菌落?；【@色平板上為藍色，菌落中心略有凹陷的菌落（注意該平板上可疑菌落易發(fā)生自凝）。取少許培養(yǎng)物（TCBS和弧菌顯色平板上的疑似菌落需轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)瓊脂小斜面或非選擇性平板后進行血清學鑒定）與O1群+O139群霍亂多價診斷血作玻片凝集試驗，如很快出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集即為陽性反應，陽性者必須用生理鹽水按同樣

5、方法作對照試驗，以排除因自身凝集而導致的假陽性反應。并繼續(xù)用小川和稻葉單價血清分型。對O1群不凝集的可疑菌落，再用O139群診斷血清作玻片凝集。2.4生化鑒定：在雙洗平板、TCBS瓊脂或弧菌顯色平板上的疑似菌落轉(zhuǎn)種在普通瓊脂平板上，選取單菌落做生化初篩，選擇單菌落做KIA和MIU實驗。進一步生化鑒定選用梅里埃生化檢測卡（API20E或API20NE），或全自動生化鑒定儀鑒定。具體操作按產(chǎn)品操作說明。2.5 PCR檢測：可使用商品化的試劑盒或按照合成引物及探針后進行PCR檢測。2.5.1 O1和O139雙重實時PCR驗證檢測，引物和探針序列見表1和表2：表2 O1和O139雙重實時熒光PCR檢測

6、的引物及探針引物名稱核苷酸序列（53）產(chǎn)物長度（bp）O1 FGGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG117O1 RTAGAGACTCACCTTCGATTTCAGCO1 PFAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1O139 FCGATGGCGTGTTCATTAGAAGG104O139 RTCCCTTTCCACCTCGGTATTTCO139 PHEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1反應體系和反應條件為：20L反應體系，2×PCR buffer 10L , O1 rfb基因上下游引物（10mol/L）各0.4L，探針（10

7、mol/L）0.4L；O139 rfb基因上下游引物（10mol/L）各0.4L，探針（10mol/L）0.4L；去離子水5.6L，DNA模板2L。循環(huán)條件為：95 30s, 95 5s和60 20s 循環(huán)40次，在退火階段檢測熒光。2.5.2霍亂弧菌毒素基因（ctx）檢測，見表2：表2 ctx毒素基因的熒光PCR檢測的引物及探針引物名稱核苷酸序列（53）產(chǎn)物長度（bp）CT1 FCTTCCCTCCAAGCTCTATGCTC114CT1 RTACATCGTAATAGGGGCTACAGAGCT1 PFAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG -BHQ1反應體系和反應條件為

8、：20L反應體系，2×PCR buffer 10L ,上下游引物（10mol/L）各0.4L，探針（10mol/L）0.4L；去離子水6.8L，DNA模板2L。循環(huán)條件為：95 30s, 95 5s和60 20s 循環(huán)40次，在退火階段檢測熒光。3.報告結(jié)果及上送菌種：報告糞便標本中檢出霍亂弧菌，保存并上送菌種。二） 沙門菌檢測操作程序1標本檢測流程圖：糞便或肛拭子挑取可疑菌落3-5個轉(zhuǎn)種于初篩生化管36±1 18h-24hSBG增菌液36±1增菌18h-24h沙門菌顯色培養(yǎng)基或SS平板36±1 18h-24h對初篩生化符合沙門菌屬的菌落進行血清學試驗結(jié)

9、果報告菌株保存2. 操作步驟：2.1 增菌：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），放入SBG增菌培養(yǎng)基中36±1增菌18-24h。2.2分離：取增菌培養(yǎng)液一環(huán)接種沙門菌顯色培養(yǎng)基上36±1培養(yǎng)過夜；2.3挑取可疑菌落：挑取可疑菌落（如科瑪嘉沙門菌顯色平板上，目標菌落紫色、淡紫色菌落；SS平板上周邊無色透明、中心黑色菌落）轉(zhuǎn)種雙管糖或其他生化篩選培養(yǎng)基（如KIA、MIU），36±1培養(yǎng)過夜；2.4生化初篩：挑取雙糖管結(jié)果為發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，甘露醇+，尿素，H2S+/，動力+，靛基質(zhì)，蔗糖的反應管菌株，或KIA、MIU的生化結(jié)果為K/A,產(chǎn)氣+，H2S+/，動力+

10、，靛基質(zhì)，尿素的反應管菌株轉(zhuǎn)種于哥倫比亞瓊脂平板及營養(yǎng)瓊脂小斜面，分別進行血清學鑒定及生化鑒定。2.5血清學鑒定：凡生化初篩結(jié)果符合沙門菌屬的可疑菌株以沙門菌屬診斷血清內(nèi)作玻片凝集試驗。(1)用O多價診斷血清作玻片凝集試驗，同時用生理鹽水作對照。多價凝集者用O單價診斷血清分別進行凝集。完成O抗原的鑒定后，先用H多價作凝集試驗，如有一種或兩種多價診斷血清凝集，再用這種多價血清的各種H因子診斷血清檢查以確定第1相和第2相的H抗原（必要時需要進行H相的誘導）。(2)查閱沙門菌血清分型表，報告血清式。推薦使用規(guī)范格式的沙門菌血清型的中英文報告方式。2.6生化試驗：選取API 20 E或微生物自動鑒定系

11、統(tǒng)進行鑒定。具體操作按產(chǎn)品操作說明。3.報告結(jié)果及上送菌種：綜合生化及血清學鑒定結(jié)果，報告糞便標本中檢出沙門菌名稱，保存并上送菌種。三） 志賀菌檢測操作程序1 標本檢測流程圖：糞便或肛拭子XLD及MAC平板 36±118h-24h對初篩生化符合志賀菌屬的菌落進行血清學試驗挑取無色、透明或半透明的可疑菌落3-5個轉(zhuǎn)種于初篩生化管36±1 18h-24h結(jié)果報告菌株保存2.操作步驟：2.1分離：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），直接在XLD一區(qū)涂抹后進行劃線分離，于36±1培養(yǎng)過夜。2.2挑取可疑菌落：從37培養(yǎng) 18 h24 h的分離培養(yǎng)基上，觀察挑選可疑菌落3

12、-5個，在XLD或MAC平板上其形態(tài)為無色，透明或半透明，圓形，濕潤、光滑、突起，接種雙管糖或其他生化篩選培養(yǎng)基（KIA、MIU），36±1培養(yǎng)過夜。2.3生化初篩：志賀菌屬在雙管糖的生化反應為：發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，甘露醇+/，尿素，H2S，動力，靛基質(zhì)+/，蔗糖?；蛟贙IA、MIU的生化結(jié)果為K/A，產(chǎn)氣，H2S，動力，靛基質(zhì)+/，尿素的反應管菌株。福氏志賀菌6型在上兩種培養(yǎng)基上有時可產(chǎn)生少量氣體。2.4血清學鑒定：凡生化初篩結(jié)果符合-志賀菌屬的可疑菌株以志賀菌屬診斷血清內(nèi)作玻片凝集試驗。查閱其血清分型表，報告最終血清型。2.5生化試驗：選取API 20 E或微生物自動鑒定系統(tǒng)

13、進行鑒定，具體操作按產(chǎn)品操作說明。在必要時需進行其他補充生化反應。應符合表3所列的生化特性。3.報告結(jié)果及上送菌種：綜合生化及血清學鑒定結(jié)果，報告糞便標本中檢出志賀菌。保存并上送菌種。表3 志賀菌屬的生化特性項目A群B群C群D群項目A群B群C群D群靛基質(zhì)dd(-)-水揚素-甲基紅+D-側(cè)金盞花醇-V.P.-+肌醇-西蒙氏檸檬酸鹽-D-山梨醇ddd-硫化氫-L-阿拉伯糖dd+尿素-棉子糖-d-苯丙氨酸-L-鼠李糖d-(+)賴氨酸-麥牙糖(-)d（-)(+)精氨酸-(-)-D-木膠糖-(-)-鳥氨酸-覃糖(+）d(+)+動力-纖維二糖-明膠-甲基-D-葡萄糖苷-KCN-七葉靈-丙二酸鹽-密二糖-d

14、(-)(-)D-葡萄糖產(chǎn)酸+D-阿拉伯糖-ONPGd-+D-葡萄糖產(chǎn)氣-D-甘露糖+乳糖-(d)衛(wèi)矛醇-蔗糖-D-甘露醇-+四） 副溶血弧菌檢測操作程序1.標本檢測流程圖：糞便或肛拭子18-24hTCBS平板科瑪嘉弧菌顯色平板36±116h-18h挑取綠色（TCBS）或紫色（弧菌顯色平板）的可疑菌落5-10個轉(zhuǎn)種于初篩生化管36±1 18-24h氯化鈉結(jié)晶紫增菌液36±1 6h-8h氧化酶實驗（+）新鮮培養(yǎng)菌落進行系統(tǒng)生化鑒定菌株保存結(jié)果報告2.操作步驟2.1分離：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），直接在TCBS一區(qū)涂抹后進行劃線分離，于36±1培養(yǎng)

15、過夜。2.2增菌：用無菌拭子采集少量糞便后轉(zhuǎn)種至8mL10mL氯化鈉結(jié)晶紫培養(yǎng)液或堿性蛋白胨水（APW）中。37培養(yǎng)6h-8h后，取一接種環(huán)，劃線接種于TCBS平板，于37培養(yǎng)18h-24h后觀察有無可疑菌落。2.3挑選可疑菌落及生化初篩：挑取TCBS上綠色、中等大小的可疑菌落，或弧菌顯色平板上紫色、中等大小菌落做生化初篩實驗。如KIA和MIU實驗，可疑菌落在KIA、MIU的生化結(jié)果為K/A,產(chǎn)氣-，H2S ，動力+，靛基質(zhì)+，尿素。并可進行氧化酶實驗，若為陽性，繼續(xù)做系統(tǒng)生化實驗。3生化鑒定：選用梅里埃生化檢測卡（API20E或API20NE），或全自動生化鑒定儀鑒定。具體操作按產(chǎn)品操作說明

16、。4.報告結(jié)果及上送菌種：綜合生化鑒定結(jié)果，報告糞便標本中檢出副溶血弧菌。五） 致瀉性大腸埃希菌檢測操作程序1.標本檢測流程圖：糞便或肛拭子18-24hO157免疫磁珠集菌mEC增菌液36±16hMAC平板O157顯色平板36±116-18h挑取桃紅色（MAC平板）或紫色（O157顯色平板）可疑菌落5個轉(zhuǎn)種于初篩生化管36±1 18h-24h對生化初篩符合株進行毒力基因PCR檢測O和H抗原的血清學鑒定結(jié)果報告菌株保存2.操作步驟2.1分離：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），直接在MAC平板上一區(qū)涂抹后進行劃線分離，于36±1培養(yǎng)過夜。2.2增菌：對于

17、EHEC O157:H7的檢測需先進行增菌，用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g）后轉(zhuǎn)種至8mL10mLmEC肉湯增菌液37增菌6h后，取1mL用O157免疫磁珠進行富集后，接種于O157顯色平板或山梨醇麥康凱平板進行劃線分離，于37培養(yǎng)18h-24h后觀察有無可疑菌落。2.3挑取可疑菌落：挑取麥康凱平板（MAC）上發(fā)酵乳糖的桃紅色、不透明的可疑菌落，或O157顯色平板上紫紅色或淡紫色、中等大小菌落，或山梨醇麥康凱平板上不發(fā)酵山梨醇的乳白色菌落進行生化初篩實驗。2.4生化初篩：可疑菌落的雙糖管結(jié)果為發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，甘露醇+，尿素，H2S ，動力+/，靛基質(zhì)+，蔗糖/+的反應管菌株，或KIA

18、、MIU的生化結(jié)果為A/A,產(chǎn)氣+，H2S，動力+/，靛基質(zhì)+，尿素。2.5PCR毒力檢測：致瀉性大腸桿菌（EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAggEC）的毒力基因及EHEC O157的菌體、鞭毛抗原的基因檢測，可使用商品化的試劑盒或參考感染性腹瀉診斷標準WS 271-2007中的引物序列及反應條件。2.6血清學鑒定：凡生化初篩結(jié)果符合的可疑菌株以大腸埃希菌屬診斷血清（包括O多價及單價，H抗原）作玻片凝集試驗。報告最終血清型。2.7系統(tǒng)生化鑒定：選用梅里埃生化檢測卡（API20E），或全自動生化鑒定儀鑒定。具體操作按產(chǎn)品操作說明。3.報告結(jié)果及上送菌種：綜合血清學，生化鑒定及PCR檢測

19、結(jié)果，報告糞便標本中檢出致瀉性大腸埃希菌的類型及血清型。保存并上送菌種。六）小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測操作程序1.標本檢測流程圖：直接分別于第7，14，21天接種耶爾森菌選擇性平板 CIN與改良PBS增菌液1:10混合4冷增菌25培養(yǎng)48h選擇形態(tài)可疑菌落（“公牛眼”狀）接種于改良克氏雙糖或三糖鐵培養(yǎng)基改良克氏雙糖斜面：黃/黃不產(chǎn)H2S 不產(chǎn)氣25培養(yǎng)24/48h25培養(yǎng)25培養(yǎng)24h分解尿素者分別接種與2管半固體培養(yǎng)基37培養(yǎng)24h動力（-）動力（+）動力（-）動力（+）且系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果報告接種于尿素培養(yǎng)基新鮮糞便結(jié)果報告2. 操作步驟：2.1直接分離：用無菌拭子采集少量糞便（約0.5g），直

20、接劃線接種于耶爾森菌選擇性平板，25培養(yǎng)48h。2.2增菌培養(yǎng)：取1g糞便標本接種于10ml改良PBS增菌培養(yǎng)液中，置于4冷增菌。在冷增菌的第7、14、21天劃線接種于耶爾森選擇性平板，25培養(yǎng)48h。2.3挑取可疑菌落：在耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基上25培養(yǎng)48小時，可疑菌落為較小的濕潤菌落，直徑約12mm。中心呈深玫瑰紅色，凸起較尖銳，周圍有明顯透明環(huán)，稱“公牛眼”。從選擇性培養(yǎng)基上挑取5個可疑菌落進行生化初篩。2.4生化鑒定：2.4.1糖分解試驗挑取可疑菌落接種改良克氏雙糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25培養(yǎng)24h-48h。挑選斜邊/底層均變?yōu)辄S色（A/A），不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)氣（可能有微量氣體，

21、小泡，但不會將培養(yǎng)基頂裂或頂起）的菌株進一步鑒定。注意：在斜面上劃線不要過稀，菌量太少不利于下一步接種Rustigian尿素培養(yǎng)基。2.4.2尿素分解試驗刮取斜面上大量菌苔，濃厚接種于Rustigian尿素培養(yǎng)基，震蕩均勻，25培養(yǎng)2h-4h，變紅色者為尿素酶陽性，進一步檢測動力。菌量少及其他未變色的菌株觀察至24h。2.4.3動力試驗將尿素酶陽性菌株接種于2管半固體，分別置于25與37培養(yǎng)24h。選取25動力（+）且37動力（-）的菌株，進行系統(tǒng)生化鑒定。2.4.4系統(tǒng)生化鑒定挑取上述可疑的菌落直接用Api20E鑒定板條進行系統(tǒng)生化鑒定，確定菌株種屬。典型的生化反應見圖1。圖1小腸結(jié)腸炎耶爾

22、森菌Api20E板條的典型生化反應2.5血清學鑒定使用致病性菌株常見血清型（我國一般為O:3、O:8、O:9型）的特異性單克隆抗體進行玻片凝集，從而進行進一步鑒定和血清分型。3.報告結(jié)果：綜合血清學及生化鑒定結(jié)果，報告糞便標本中檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。保存并上送菌種。六） 空腸彎曲菌檢測操作程序1. 標本檢測流程圖：糞便或肛拭子18-24h42微需氧（85% N2，10% CO2，5% O2）2-3天滴加到放置在血平板上的0.45微米孔徑的濾膜上，放置30-45min后，去濾膜用生理鹽水配置成1ml的糞便懸液挑取血平板上的可疑菌落進行革蘭染色鏡檢，生化鑒定及PCR鑒定結(jié)果報告菌株保存2操作步驟

23、2.1分離培養(yǎng)：用無菌拭子采集少量糞便（0.5g-1g）混懸于1ml生理鹽水,取約200微升滴加到放置在血平板上的0.45微米孔徑的濾膜上，室溫或37放置30min-45min后，去濾膜。將平板倒置后42微需氧（85% N2，10% CO2，5% O2混合氣體培養(yǎng)箱或者使用密閉容器如強塑厭氧盒，放入適量的微需氧產(chǎn)氣袋）培養(yǎng)，2-3天后開始觀察菌落形態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)710天仍無疑似菌落才可丟棄初次分離平皿。2.2鑒定2.2.1形態(tài)鑒定：菌落形態(tài)鑒定：初次分離培養(yǎng)2-3天，血平板上的菌落不溶血，扁平、濕潤、有光澤，看上去像水滴，直徑為12mm，邊緣完整、發(fā)亮，5-6天后菌落增大，顏色變灰白，扁平，菌落

24、不溶血。革蘭氏染色鏡檢：空腸彎曲菌為革蘭氏染色陰性菌，鏡下呈弧形，S形或螺旋狀彎曲桿菌。2.2.2生化鑒定對于空腸彎曲菌的生化鑒定首先進行氧化酶和觸酶檢測，氧化酶和觸酶陽性者進行馬尿酸鹽水解試驗檢測空腸彎曲菌特異的馬尿酸水解酶基因的活性?？漳c/結(jié)腸彎曲菌的生物化學鑒定結(jié)果解讀見表4：表4空腸彎曲菌/大腸彎曲菌生化鑒別特征生化反應項目空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌氧化酶試驗+過氧化氫酶試驗+馬尿酸鹽水解試驗+-2.2.3 PCR鑒定：可選用商品化的PCR試劑盒或合成引物進行PCR檢測。利用多重PCR方法擴增空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌特異基因，PCR引物序列和產(chǎn)物大小見表5，PCR擴增圖片見圖2。PCR鑒定既可以進行多重PCR鑒定，同時可以分為兩組：空腸（16S rRNA+MapA基因），結(jié)腸（16S rRNA+CeuE基因）分別進行PCR，根據(jù)產(chǎn)物片段大小鑒定。表5多重PCR引物序列以及產(chǎn)物大小基因名稱引物序列PCR 產(chǎn)物16S rRNA(彎曲菌屬16S rRNA)16F: 5-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3857bp16R: 5-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3MapA(空腸彎